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M E T A B O L I S M O Estequiometria e balanço de fluxos (em perspectiva sistêmica) Notas de Aula Manuel Mateus Ventura Brasília, 2006.

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1 M E T A B O L I S M O Estequiometria e balanço de fluxos (em perspectiva sistêmica) Notas de Aula Manuel Mateus Ventura Brasília, 2006

2 2 M E T A B O L I S M O Estequiometria e balanço de fluxos (em perspectiva sistêmica) Notas de Aula (apresentação em MS - ppt) por Manuel Mateus Ventura Brasília, 2006

3 3 Estas notas de aula visam apresentar aos estudantes de graduação e, particularmente, aos de pós-graduação, na área de Biologia, um dos tópicos de maior relevância teórica e prática, que se insere em Biologia de Sis- temas. São um esforço didatização. (para contacto). Disponível em jun-2006 corrigido em

4 4 REAÇÕES QUÍMICAS Reações químicas ocorrem quando moléculas que se encontram alteram suas composições e estruturas com reordena- ção de seus átomos constitutivos e surgi- mento de outra(s) molécula(s).

5 5 REAÇÕES QUÍMICAS 2 Equação estequiométrica: indica as es – pécies que participam da reação (reagen - tes e produtos) e suas proporções mole - culares relativas (estequiometria): a 1 A 1 + a 2 A a n A n = b 1 B 1 + b 2 B b m B m ou, de forma mais compacta, r a r A r - P b P B P = 0 r = 1, 2,..., n p = 1, 2,..., m

6 6 Equações de reações ij a ij X j = 0 i = 1,..., m reações j = 1,..., n espécies R 1 a 11 X 1 + a 12 X a 1n X n = 0 R 2 a 21 X 1 + a 22 X a 2n X n = R m a m1 X 1 + a m2 X a mn X n = 0

7 7 A equações estequiométricas em forma matricial: a 11 a a 1m X 1 a 21 a a 2m X 2 = a n1 a n2... a nm X m a 11 X 1 + a 12 X a 1m X m 0 a 21 X 1 + a 22 X a 2n X m = 0 = a m1 X 1 + a m2 X a mn X m 0

8 8 Conservação de elementos A equação estequiométrica deve ser balanceada para os elementos que constituem as espécies moleculares (reagentes e produtos) que participam da reação. Os elementos conservam seus números atômicos Z.

9 9 Matriz de elementos: Cada de seus elementos dá o número de átomos de um elemento químico por mo- lécula de reagente ou produto. Exemplo, a seguir.

10 10 Consideremos a reação: GLICOSE(G) + ATP = G6P + ADP + H + Matriz de elementos: G ATP G6P ADP H + H C E = O N P

11 11 Conservação da carga: Em uma reação deve haver balanço de carga elétrica. Matriz de carga: para a reação anterior, tem-se G ATP G6P ADP H + C el =

12 12 Redes de reações químicas Estamos habituados a ver seqüen- cias de reações que se ramificam ao nível de espécies moleculares que participam das transformações químicas. Por exemplo: E A B C F D

13 13 Nessas redes, distinguem-se nós ou vértices, em correspondência às espécies moleculares e cone- xões ou arestas que indicam as transformações químicas entre os nós. Em sistemas muito complexos, como os do metabolismo celular, as redes de multirreações interconectadas podem ter tamanho enorme, constituidas por milhares de nós e conexões.

14 14 Redes biológicas são representa- ções abstratas de sistemas biológi- cos, que apresentam muito das propriedades fundamentais desses sistemas. De tais características, destacam-se: a)modularidade, b)robustez ou resiliência e c)recorrência na utili- zação de certos elementos.

15 15 Redes de moléculas e reações entre elas são o centro da atividade celular, a qual resulta, no todo, da combinação de todas essas redes (metabolismo e seu controle, sinalização, expressão gênica etc.)

16 16 A arquitetura (topologia) de uma rede relaciona-se à sua robustez ou resiliência, ou seja, a capacidade de resistência aos agentes externos e internos que podem afetar ou destruir a integridade da rede.

17 17 Redes biológicas são sistemas dinâmicos, i.e., seu estado global evolui no tempo. A dinâmica de uma rede depende dos estados internos atingidos pelos seus vértices e sua evolução temporal.

18 18 O estudo de redes como um todo está a levar à descoberta de propri- edades e princípios gerais válidos para as mais diversas redes, inclusi- ve biológicas. Para esse fim, a contribuição de físi- cos tem sido relevante, por meio de uma ferramenta adequada- a mecâ – nica estatística.

19 19 A representação de sistemas biológicos por redes tem a vantagem de permitir o uso de conceitos e procedimentos da teoria dos grafos, a qual tem sido muito usada em tecnologia.

20 20 GRAFOS: representação simbólica de interações ou transformações entre quaisquer entidades(molécu- las,elementos em crcuitos elétricos, indivíduos em uma população,ecos- sistema ou grupo social,emissores e receptores de informação etc.). Grafos são entidades matemáticas.

21 21 METABOLISMO O metabolismo da célula viva é uma rede (network) de interconversões de espécies químicas pela qual a célula obtém os blocos estruturais e a energia necessários à sua organização estrutural e funcional. É um conjunto de reações químicas conecta- das e integradas, caracterizado por uma topo- logia e uma dinâmica. As reações são, em ge- ral, catalisadas por enzimas. Além de reações, podem ocorrer processos de transporte.

22 22 Genética Proteínas Metabolismo Sinalização Biologia Celular Química - Computação- Biologia de sistemas

23 23 ERA PÓS-GENÔMICA (dados produzidos em alto fluxo por NMR, MS, 2d-gel, DNA arrays, two- -hybrids technique etc.) (com base no Dagstuhl Seminar on Integrative Bioinformatics 2004) segue

24 24 BIOLOGIA MOLECULAR Meta- OGE PRR Prote- Trans- bolismo ômica criptômica OGE:organização genômica estrutural Metabo- PRR:padrões de regiões regulatórias lômica

25 25 CERCA DE 600 BASES DE DADOS E VÁ - RIAS FERRAMENTAS ANALÍTICAS DISPO- NÍVEIS NA WEB CIÊNCIA DA TAREFAS COMPUTAÇÃO BIOLÓGICAS ( MÈTODOS E (EXPERIMEN- CONCEITOS) TAIS)

26 26 A N Á L I S E (extração de informação) integração desafio BIOINFORMÁTICA INTEGRATIVA (novos níveis de entendi- mento) CÉLULA VIRTUAL

27 27 O funcionamento de uma célula envolve um sistema altamente complexo de processos químicos interconectados, o metabolismo, cuja reconstrução, constitui a meta final da biologia de sistemas.

28 28 Metabolismo decompõe nutrientes em mo- léculas mais simples e energia (catabolismo); sintetisa moléculas orgânicas complexas (ana- bolismo), as quais são a base estrutural e funcional da célula. Metabolismo compreende: - reações químicas catalisadas por enzimas -metabolitos: pequenas moléculas consumi das e produzidas nos processos químicos.

29 29 Dado o papel relevante das enzimas, po – de-se dizer que o metabolismo celular é a expressão bioquímica (fenótipo bioquímico) do genoma. 1 - Uma enzima pode catalisar mais de uma reação química (promiscuidade de subs- trato); as reações catalisadas apresen – tam, geralmente, similaridade. 2 – Enzimas podem ser formadas por mais de uma cadeia peptídica e constituir oligô- meros.

30 30 3 – Mais de uma enzima podem catalisar a mesma reação química. Assim, o número de enzimas não corres – ponde ao número de genes que as codifi cam e ao número de reações catalisadas.

31 31 O METABOLISMO E SUA RE- GULAÇÃO SÃO AS FUNÇÕES MAIS FUNDAMENTAIS DE UMA CÉLULA

32 32 RECONSTRUÇÃO METABÓLICA identifica, categoriza e interconecta genes, proteínas, reações e metaboli- tos que participam do metabolismo de um sistema biológico para constituir uma rede, a qual pode ser usada como base para caracterizar crescimento e predizer fenótipos celulares.

33 33 Reconstrução metabólica GENOMA SEQUENCIAMENTO (base de dados) ANOTAÇÃO (identificação de segmentos codificantes+ dados bioquímicos e fisiológicos) RECONSTRUÇÃO da rede metabólica e regulatória

34 34 A modelagem e simulação de redes metabólicas são de grande relevân- cia para o entendimento quantitati - vo do metabolismo de um micro- organismo e servem ao aperfeiçoa- mento deliberado das capacidades metabólicas por meio das técnicas de DNA recombinante (engenharia metabólica).

35 35 SIMULAÇÕES COMPUTACIONAIS: VANTAGENS: podem mostrar a não viabilidade de hipó- teses aparentemente plausíveis e, ao confirmarem uma hipótese, podem prover predições quantitativas e mesmo direcio- nar o trabalho experimental. Entretanto, não se deve esquecer de que usam modelos e são simulações.

36 36 A enorme massa de dados de que se dispõe e que resulta de técnicas analíticas de alto fluxo (high throughput) está a exigir o aperfei - çoamento intenso e contínuo de algorítmos que possibilitem o tra- tamento computacional para atingir o entendimento integrado da dinâ- mica celular (tecnologias- omics).

37 37 Os dados que resultam do tra - balho experimental com células vivas constituem a base para trabalhar com a modelagem com- putacional do metabolismo. Simulação e modelagem,contudo, são de relevância em conseguir, a partir desses dados, visão mais pene- trante da dinâmica dos sistemas em estudo.

38 38 Para ter em mente ! The important thing in science is not so much to obtain new facts as to discover new ways of thinking about them. Sir William Bragg

39 39 ABORDAGEM CINÉTICA NO ESTUDO DO METABOLISMO

40 40 A expressão das velocidades de reações químicas por equações diferenciais, com base na lei de ação das massas, tem possibili- tado o estudo da evolução no tempo de sistemas metabólicos não muito complexos, i.e., em es- cala subgenômica.

41 41 Tem sido o procedimento adotado na cinética enzimática, para o estu- do de enzimas individuais ou em pequeno número. Exige que sejam conhecidas as cons- tantes de velocidade das reações envol- vidas, o que representa grande obstáculo no estudo de redes metabólicas com- plexas, em escala genômica.

42 42 Contudo, eritrócito e mitocôndrio têm tido seus metabolismos estudados por via cinética.

43 43 Para a reação k 1 aA + bB cC + dD, k -1 tem-se v = - (1/a)d[A]/dt = - (1/b)d[B]/dt = 1/c)d[C]/dt = (1/d)d[D]/dt v = velocidade da reação k 1,, k -1 = constantes de velocidade

44 44 As equação cinética será v = v - v = k 1 [A] α [B] β - k -1 [C] γ [D] δ onde os expoentes indicam a ordem cinética relativa a cada reagente; a ordem cinética da reação, n = α + β + γ + δ. Note-se que as ordems cinéticas podem não ser necessariamente Iguais aos respectivos coeficientes estequiométricos.

45 45 Seqüências de reações. Seja o seguinte caso simples: k 1 k 2 X 1 X 2 X 3 X 1 ´= dX 1 /dt = - k 1 [X 1 ] X 2 ´= dX 2 /dt = k 1 [X 1 ] – k 2 [X 2 ] X 3 ´= dX 3 /dt = k 2 [X 2 ] [X 1 ] 0 + [X 2 ] 0 + [X 3 ] 0 = [X 1 ] t + [X 2 ] t + [X 3 ] t estado estacionário: X 1 ´= X 2 ´= X 3 ´= 0

46 46 No estado estacionário, os fluxos de reação não se anulam, como no equilíbrio, mas compensam-se de tal modo que dX i /dt = 0. Neste caso, as equações diferenciais da cinética convertem-se em um sistema de equações algébricas simultâneas.

47 47 Integração das equações cinéticas: - em forma analítica ou exata, possível somente em casos especiais; - por métodos numéricos,aproxima- dos e computacionais

48 48 Equações cinéticas para sequên- cias de reações, lineares ou ramificadas, podem ser obtidas pelo método computadorizado de King- Altman, bem conhecido em cinética enzimática.

49 49 Programas para o estudo cinético do metabolismo: dos inúmeros disponíveis, indica- remos os seguintes: GEPASI Pedro Mendes //www.gepasi.org; E-cell2 Keio University; CellDesigner V The Systems Biology Institute //www.celldesigner.org

50 50 M A T R I Z E S T E Q U I O M É T R I C A S um conceito básico em análise do metabolismo

51 51 Matriz estequiométrica (S) S mn é uma matriz de ordem mxn, onde m filas correspondem ao número de espécies químicas (substratos e produtos) e n colu – nas indicam o número de reações envolven- do essas espécies. Os elementos de S são os coeficientes este- quiométricos a ij das espécies que correspon- dem às filas i e colunas j i = 1,2,...,m j = 1,2,...,n S = a ij a ij 0 produtos a ij = 0

52 52 UM IMPORTANTE CONCEITO O conceito de matriz estequiométrica é es – sencial para representar e analisar mate – maticamente os sistemas metabólicos. Possibilita o uso da álgebra linear, inclusive da análise convexa, em bioinformática e biologia computacional.

53 53 Matriz estequiométrica 2 R 1 R 2 R n reações j = 1,...,n a 11 a a 1n espécies S = a 21 a a 2n químicas i = 1,...,m a m1 a m2... a mn a ij : coeficientes estequiométricos a ij 0 produtos a ij = 0 a espécie molecular i não participa da reação j

54 54 Na matriz estequiométrica, como definida aqui, temos: a)as filas de S representam as espécies químicas (substratos e produtos); b)as colunas de S indicam as reações; c)os elementos de S são os coeficientes estequiométricos a ij com sinal negativo para substratos e positivo para produtos. a ij = 0 indica que a espécie i não partici – pa da reação j.

55 55 Subespaços de S: a 11 a a 1n espécies: 1,..., m S = a 21 a a 2n reações: 1,..., n a m1 a m2... a mn S pode ser representada tanto pelos vetores coluna quanto pelos vetores fila: r T 1 a 1k a i1 S = c 1... c n =. c k =. r i =.... r T m a mk a in

56 56 Subespaço de vetores coluna: é determinado pelo conjunto de vetores coluna de S e denotado por R(S). R(S) determina o espaço de concentração dinâmico. Os vetores coluna, que correspondem às reações químicas da rede metabólica consi- derada e que constam de S, contribuem para as variações das concentrações dos metabolitos.

57 57 Subespaço de vetores fila: é determinado pelo conjunto de vetores fila. e denotado por R(S T ). No espaço de fila estão as variações de concentração que contribuem às taxas de fluxo das reações.

58 58 Posto (rank) de uma matriz, r. Definição. O posto de uma matriz A é a ordem da maior sub-matriz quadrada cujo determinante não é nulo. Ex.: A = detA = = = = O posto de A não pode ser 3, pois detA = 0, mas é igual a 2, como se pode ver.

59 59 Proposição. O posto da matriz A é igual à dimensão do subespaço de seus vetores coluna ou vetores fila: postoA = dimR(A) = dimR(A T ) = r

60 60 ESPAÇO –N U LO DE S Definição. O espaço –n u l o (direito) da matriz S é o conjunto de todas as soluções v 1 v =... = v 1... V n T v n das soluções do sistema de equações Sv = 0, o qual corresponde ao estado estacionário.

61 61 O espaço-n u l o é um subespaço e é denotado por N(S) ou nulo(S). Se r = posto de S mn, tem-se dimN(S) = n-r, N(S) R(S T ) N(S) determina o espaço que compreende os caminhos de estado estacionário da rede metabólica considerada.

62 62 Espaço-nulo (esquerdo) de S mn é o con – junto das soluções y 1 y =... = y 1... y m T y m do sistema de equações S T y = 0. É denotado por L = N(S T ) ou nulo(S T ) e tem-se dim(S T ) = m-r, N(S T ) R(S).

63 63 Seja a equação de balanço dinâmico dx/dt = Sv = 0 e multipliquemos ambos os membros por L: Ldx/dt = LSv = 0 Ldx/dt = 0 Lx = const. A última expressão indica que os vetores de L definem as relações de conservação entre concentrações de metabolitos em uma rede metabólica.

64 64 Matriz de espécies (reagentes e produtos) Vetor coluna: X m = X 1 X 2... X m T

65 65 CONSERVAÇÃO DE ELEMENTOS Seja a reação G+ATP = G6P+ADP+H + G ATP G6P ADP S = H C = 0 = 0 O N P E S T = 0

66 66 CONSERVAÇÃO DA CARGA ELÉTRICA G ATP G6P ADP S = C el = C el S T = 0 A ortogonalidade entre C el e S T indica a conservação da carga.

67 67 MATRIZ ESTEQUIOMÉTRICA:um exemplo mais complexo Uma seqüência de reações da glicólise: R1 Glicose(G) + ATP = G6P + ADP + H + R2 G6P = F6P R3 F6P + ATP = FBP + ADP + H + R4 FBP = 63P + DHAP R5 2G3P + NAD + + P i = BPG + NADH + H + S, a seguir

68 68 R1 R2 R3 R4 R5 G -1 ATP ADP 1 1 G6P 1 -1 F6P 1 -1 FBP 1 -1 G3P 1 -2 = S DHAP 1 BPG 1 NAD + -1 NADH 1 P i -1 H Posições em branco correspondem a zeros.

69 69 S de uma rede metabólica X 1 X 2 X 3 X 5 X 4 X 6 X 7 R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 R 7 X 1 -1 X X X X X X 7 1 1

70 70 Conectividades em S S é uma matriz que conecta todas as es- pécies químicas (metabolitos) que partici – pam de um determinada sistema metabóli – co. Propriedades de conectividade. -Número de participação: número de vezes que um metabolito participa das -reações do sistema. É, no mínimo, 2 para -Metabolitos internos. -Número de moléculas em uma reação: soma -de todos os coeficientes estequiométricos na equação -de uma reação.

71 71 Partição de S A matriz estequiométrica plena S abrange reações internas (n) e metabolitos internos (m) da célula que correspondem a uma par- tição denotada por S int. Entretanto, outras partições ou subpartições podem ser consi- deradas, como para substratos, produtos, Intermediários metabólicos, constituintes de biomassa e reações de troca entre organe- loas e outros compartimentos da célula.

72 72 Partição de S S int S = S ext

73 73 Partição de S: exemplo específico R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 Glicose -1 subtratos Succin.. 1 Lactato 1 H 2 1 produtos Acetato 1 etanol PEP NAD NADH intermediários CO ATP 1 1 Acetl-CoA

74 74 No sistema metabólico da célula, as espé- cies químicas que participam das várias reações são distinguidas como a) substratos, b) produtos metabólicos, c) metabolitos intermediários e d) produtos de biomassa. O termo metabolito, freqüentemente, tem significação abrangente.

75 75 Coeficientes estequiométricos: α ij para substratos X s ; β ij para produtos metabólicos X p ; γ ij para constituintes de biomassa X b ; g ij para metabolitos interme- diários X int. Para as j reações, tem-se j i α ij X s + j i β ij X p + j i γ ij X b + j i g ij X int =0 A seguir, em forma matricial :

76 76 Estequiometria global da célula em forma matricial: A T X s + B T X p + Γ T X b + G T X int = 0 ou ainda, por partição da matriz estequio – métrica única para o sistema. S T X s X p = X b X int

77 77 REAÇÕES E FLUXOS As reações químicas do metabolismo podem ser vistas como fluxos de matéria associados a trocas de energia e processos de transporte. Ao serem referidas, reações são quase sem- pre tomadas como os fluxos que ocorrem através delas. As redes metabólicas são fluxos interconecta- dos que a célula viva mantém sob controle por me – canismos de modulação enzimática (ativação e ini- rição) e regulação da expressão de genes.

78 78 Fronteiras em sistema metabólicos Sistemas metabólicos podem ser delimi – tados por fronteiras, físicas ou não. Ao ser definida a fronteira, tem-se - interior, onde está o sistema metabólico considerado; - exterior. Fluxos internos ocorrem no interior e fluxos externos entre o interior e o exterior.

79 79 Rede metabólica v 6 b 2 v 3 D E b 1 v 1 v 2 v 4 A B C v 5 F G v 7 b 3 fronteira

80 80 Matriz estequiométrica da rede: R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 R 7 b 1 b 2 b A 1 -1 B C S = D 1 -1 E 1 -1 F 1 -1 G

81 81 Vetor de concen- Vetor de fluxo tração v 1 v 2 x 1 v 3 x = x 2 v = v 4. v 5. v 6. v 7 x m b 1 b 2 b 3

82 82 O vetor de fluxo é função das concentra – ções e das constantes cinéticas k das reações: v = v (k j ) j = 1, 2,..., n k j são parâmetros experimentais de difícil determinação e nem sempre disponíveis. As velocidades de reação são funções não lineares das concentrações dos metabolitos, na forma dada na cinética química.

83 83 Equação de balanço dinâmico : dx/dt = S v Estado estacionário: dx/dt = S v = 0 Metabolitos intermediários não variam suas concentrações dentro do intervalo de tempo dos experimentos. São consumi- dos na mesma taxa em que são produzi- dos.

84 84 O estado estacionário, onde dX i /dt = 0, é uma idealização, matematicamente van- tajosa. A escala de tempo dos processos enzimá- ticos, comparada com a dos vários pro – cessos fisiológicos, justifica a aproxima – ção do estado estacionário. O tempo t não está presente nas equa – ções de balanço do estado estacionário.

85 85 dx/dt = S v = 0 R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 R 7 b 1 b 2 b 3 v 1 -v 1 -b v 2 v 1 -v v 3 v 2 -v 3 +v 4 -v v 4 v 3 -v 4 -v v 5 = v 7 -b v 5 v 5 -v v 6 v 7 -b b 1 b 2 b 3

86 86 A consideração do estado estaci- onário permite substituir sistemas de equações diferenciais em sis- temas de equações algébricas li- neares. As derivadas dx/dt não mais apa- recem.

87 87 Para ilustração, tome-se a rede metabólica (grafo) simples: b 1 v 1 b 2 X 1 X 2 v 2 v 3 v 4 X 3

88 88 O balanço de fluxo em estado estacionário: dx/dt = S v = o X i ´ = dX 1 ´ /dt v 1 X 1 ´ v 2 0 X 2 ´ = v 3 = 0 X 3 ´ v 4 0 b 1 b 2

89 89 v v 2 -v 1 -v 2 -b v 3 = v 1 +v 3 -v 4 -b v 4 v 2 -v 3 +v 4 b 1 b 2

90 90 Balanço de fluxos em estado estacionário dX 1 /dt = -v 1 -v 2 -b 1 = 0 dX 2 /dt = v 1 +v 3 -v 4 -b 2 = 0 dX 3 /dt = v 2 -v 3 +v 4 = 0

91 91 RESTRIÇÕES ADICIONAIS Sobre fluxos internos: v j 0 j = 1,...,n Sobre fluxos externos: exterior sistema b j 0

92 92 CONE DE FLUXOS n >> m : o número de reações excede de muito o número de metabolitos, o que correspon – de a dizer que o número de colunas de S é muito maior do o número de filas.

93 93 Os sistemas de equações line- ares homogêneas formados pelas equações de balanço di- nâmico do estado estacionário, S v = 0, têm um número infinito de solu- ções em seu espaço-nulo.

94 94 Ao tomar em conta as restri – ções (inequações) impostas ao sistema, a análise convexa mostra que o espaço de solu- ção é um cone poliédrico com- vexo, o qual contém todos os pontos do espaço-nulo de co- ordenadas não negativas, mais os pontos correspondentes aos fluxos externos de coordenadas negativas.

95 95 Palsson & Schuster propõem que o espaço inteiro de fluxo, no qual estão contidas as so- luções do sistema, representa a capacidade da rede metabó- lica considerada.

96 96 CONE DE FLUXO (estado estacionário) p1p1 p3p3 p2p2 p4p4 p i arbitrários, somente para ilustração

97 97 Caminhos extremos (extreme pathways) Constituem um número míni – mo de vetores que, por combi- nação linear, podem gerar qualquer vetor do cone de fluxo: v = i w i p i, w i 0, i = 1,..., k

98 98 Caminhos extremos: são as arestas do cone poliédri – co; não podem ser representados por combinações de quaisquer outros vetores do cone, lembrando o que ocorre com os vetores de base de um espaço vetorial; são conicamen- te independentes (Schilling).

99 99 Caminhos extremos: qualquer vetor do cone polié - drico pode ser representado por combinação linear não ne- gativa dos vetores de caminho extremo.

100 100 Cada caminho-extremo de um cone poliédrico corresponde a um conjunto de fluxos que sa- tisfaz à equação de balanço de massa mais as restrições.

101 101 Restringindo o cone de estado estacionário: vimos que esse cone contem um número infinito de solu – ções; somente algumas soluções têm significação fisiológica.

102 102 Restrições relativas a fluxos ex- ternos têm que ser considera- das, além das que já foram citadas, tais como o organismo, ambiente, disponibilidade de substratos, transporte por difu- são e outras. Todas essas restrições resultam em diminuição do espaço de fluxo.

103 103 DISTRIBUIÇÃO OTIMIZADA DE FLUXOS pode ser computada com re- lação a uma certa função-objeti- vo,linear, Z = j c j v j.

104 104 Escolhida a função-objetivo Z, a otimização (minimização/maxi- mização) de Sv =0 + restrições é um problema de programação linear (PL), geral – mente resolvido pelo algorítmo simplex.

105 105 A escolha de Z: a função Z deve atender à maxi- mização (ou minimização) de uma determinada característica da rede metabólica: crescimento celular (max.); concentração de um determina- do metabolito (max./mini.); demanda de energia (mini.) etc.

106 106 Determinação dos caminhos extremos de uma rede metabó- lica pelo algorítmo de Shilling: Schlling,C.H.,Letscher,D. and Palsson,B.O J. theor. Biol. 203:

107 107 Retome-se a rede metabólica (grafo): b 1 v 1 b 2 X 1 X 2 v 2 v 3 v 4 X 3 e, a seguir, sua matriz S.

108 108 v 1 v 2 v 3 v 4 b 1 b 2 X S = X X metabolitos 4 fluxos internos, 2 fluxos externos

109 109 Matriz inicial: S T unida a I 4x4 X 1 X 2 X v 1 T (0) = v v v 4 T (E) b b 2

110 110 Na matriz inicial, identificar os metabolitos que não têm fluxos externos a eles associa- dos e cujo número é denotado por μ. O metabolito X 3, como se pode ver, é o úni- co a não estar associado a um fluxo externo. Assim, tem-se μ = 1. A seguir, forme-se uma nova matriz por cópia de todas as filas de T (0) que contenham um zero na coluna de S T que corresponda a X 3. No ca- so presente, copia-se somente a 1a. fila. Em continuação, sejam adicionadas todas as combi- nações possíveis, de tal modo que se tenha zero na coluna que corresponde a X 3.

111 111 Do procedimento anterior, tem-se X 1 X 2 X v v 2 T ( μ) = v b b 2

112 112 A partir da matriz T (μ), é formada a matriz final T (final) : v 1 v 2 v 3 v 4 b 1 b 2 p T (final) = p p donde os caminhos extremos: p 1 = v 1 – b 1 +b 2, p 2 = v 2 + v 3 -b 1 +b 2 p 3 = v 3 + v 4

113 113 Exemplo Verifique se o vetor v = T está contido no cone de fluxo da rede metabólica em consideração 5 v 1 v 2 v 3 v 4 b 1 b 2 2 p p = 0 = 0 p

114 114 Rede metabólica (grafo): b 1 v 1 p 1 b 2 X 1 X 2 p 2 v 2 v 3 v 4 X 3 p 3 com caminhos extremos indicados

115 115 MATRIZ ESTEQUIOMÉTRICA Análise por DECOMPOSIÇÃO DE VALOR SINGULAR (SVD) Por conveniência, é usada a abreviação em inglês.

116 116 DECOMPOSIÇÂO DE VALOR SINGULAR (SVD) DE UMA MATRIZ. Definição matemática. Seja A mxn uma matriz de elementos reais, geral. A decomposição de valor singular de A mxn é a fatoração A = U mxm mxn (V nxn ) T, onde U mxm = matriz de vetores singu- lares esquerdos, mxn = matriz diagonal e V nxn = matriz de vetores singulares direitos.

117 117 Os elementos da matriz diagonal mxn são os valores singulares: σ 1 σ 2... σ n, os quais são as raizes quadradas (não nu- las) dos autovalores (eigenvalores) de AA T e A T A. U contém o espaço de coluna e o espaço nulo esquerdo. V contém o espaço de fila e o espaço nulo de A. O espaçp de fila contém informação termodinâmica.

118 118 Colunas de U e V fornecem bases orto – normais para os 4 subespaços fundamen – tais de S. As primeiras colunas de U e V fornecem bases ortonormais para os espaços de co – luna e fila, respectivamente. As restantes m-r colunas de U dão uma base ortonormal para o espaço-nulo esquer- do. As n-r colunas de V dão uma base orto – normal para o espaço-nulo.

119 119 Mapeamento entre vetores singulares S = U V T SV = U V T V = U Sv k = σ k u k S mapeia o vetor singular direito sobre o vetor singular esquerdo por meio do valor singular correspondente.

120 120 SVD tem aplicações em várias áreas de ciência e técnica e pode ser usada para Identificar e caracterizar os aspectos bio- químicos dominantes da rede metabólica. SVD mostra aspectos interessantes e de utilidade da matriz decomposta, os quais não são aparentes na matriz original. A análise de S por SVD, a despeito de não tratar explicitamente da dinâmica da rede considerada, fornece informação topológica sobre relações sistêmicas entre metabolitos e fluxos.

121 121 SVD torna evidentes aspectos úteis e im- portantes da matriz decomposta,os quais não podem ser vistos diretamente a par- tir da matriz original. As matrizes componentes U,,V são, em geral, ortogonais e independentes. Os vetores singulares(modos) são ortonor- mais. U T U = I mxm V T V= I nxn

122 122 Combinação linear de metabolitos e de fluxos. dx/dt = Sv S= UV T multiplicando por U T U T dx/dt = U T UV T v = V T v d(u k T x)/dt = σ k (v k T v) k = 1,...,r r : posto de S ; u k :vetor sing. esquer; V k : vetror singular direito.

123 123 Continuação Do procedimento anterior, vemos que há uma combinação linear de fluxos v k T v = v k1 v 1 + v k2 v v kn v n que movimenta uma combinação linear de Metabolitos. Os v k são contrbuições de eigen- reações. u k T u = u k1 x 1 + u k2 x u kr x m em uma extensão dada por σ k (valor singu- lar). Os u k equivalem aos coeficientes este - quiométricos sistêmicos.

124 124 Desde que, em SVD, os vetores singulares são ortonormais um ao outro, cada dos k mo- vimentos é desacoplado dos demais. Então, a combinação linear de concentrações dada para u k T u pode ser considerada como uma reação sistêmica desacoplada e impul – sionada pela combinação linear de reações definidas em v k T v. As reações metabólicas sistêmicas ou eigen- reações podem descrever a rede metabólica como um todo.

125 125 Seja U V T SV = U V T V = U Assim, tem-se Sv k = σ k u k o que significa que S mapeia o vetor singu- lar direito sobre o vetor singular esquerdo, por meio do valor singular relativo.

126 126 Tratamento semelhante ao dado acima tem sido usado em análise de expressão de genes por SVD. Alter, O., Brown, P.O., Botstein,D. Singular Value decomposition for genome-wide expression data processing and modeling. PNAS 97(18) (2000)

127 127 Computação dos valores singulares Tomemos uma simples reação de isome- rização que consiste na interconversão v 1 AB BA ou X 1 X 2 v 2 A decomposição de valor singular (SVD) da matriz estequiométrica (S) dessa reação é obtida como a seguir:

128 128 Continuação v 1 v 2 X = 2 -1/ / X S = U V T A 2a. coluna de U compreende o espaço-nulo esquerdo de S. A 2a. fila de V T compreende o espaço-nulo (direito) de S.

129 129 Computação dos valores singulares Seja a matriz estequiométrica S 3x6 corres- pondente à rede metabólica anterior: v 1 v 2 v 3 v 4 b 1 b 2 X S = X X A SVD de S pode ser obtida pelo uso do matrix-calculator acessado em //www.bluebit.gr/matrix-calculator/ calculate.asp (resultado a seguir)

130 130 Decomposição SVD: U= = , V=

131 131 MODOS ELEMENTARES DE FLUXO

132 132 Modo de fluxo: distribuição de fluxos estacionários que mantêm proporções fixas. 1 v v 2 v 1 / v 2 = constante

133 133 Formalmente, o modo de fluxo, M, é definido com o conjunto M = {V Є R r : V = λ V*, λ >0}, satisfazendo às condições: estado estacionário, SV* =0; para reações irreversíveis, tem-se que um subvetor de V, V* irr >=0.

134 134 Modo elementar de fluxo: um modo de fluxo indecomponí- vel; compreende um conjunto mínimo de reações enzimáticas irreversíveis e em regime estacionário; o conjunto de modos elementares E é único para uma dada rede meta- bólica.

135 135 Por computação dos modos ele- mentares de fluxo (E), uma rede metabólica pode ser decomposta em partes mínimas, sob a condi- ção de estado estacionário. Os aspectos essenciais da estru- tura da rede podem tornar-se apa- rentes.

136 136 Combinação linear de fluxos: uma distribuição de fluxos pode ser representada por uma com- binação linear de fluxos elemen- tares: V = λ 1 e 1 + λ 2 e = i λ i e i λ i 0

137 137 ANÁLISE DE ROTAS METABÓLICAS POR MODOS ELEMENTARES DE FLUXO Schuster,S., Fell, D., Dandekar, T. : A general definition of metabolic pathways useful for systematic organization and analysis of complex metabolic networks. Nature Biotechnol. 18(2000)

138 138 O programa usado para computar modos elementares de fluxo E em redes metabólicas: Y A N A Dep Bioinformatics, Univ. of Würzburg //yana.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de

139 139 O algorítmo sobre o qual YANA é baseado não será detalhado aqui. Pode ser achado em //www.mpi-magdeburg.mpg.de/de/research/projects/ 1010/1014/1020/mfaeng/mfapric.html //www.biomedcentral.com/ /6/135

140 140 Como ilustração, pode ser executado o exemplo (contido na distrbuição do YANA) que permite computar os modos elementares de fluxo para a rota das fosfopentoses (arquivo glycolysis+ppp.sbm). A matriz estequiométrica da sub-rede con- siderada é computada de início. Dados de entrada e saída são listados e gra- ficados.

141 141 ANÁLISE DE BALANÇO DE FLUXOS EM REDES META- BÓLICAS. PROGRAMA DE COMPUTADOR FBA versão 2.0 por Jeremy S. Edwards e Bernhard Palsson

142 142 Capacidades do software FBA: Calcula distribuições ótimas de fluxo para função-objetivo defini- da pelo usuário. Permite estudar o efeito da supres- são de genes. Gera mapa de fluxos.

143 143 Um excelente primer de FBA (Nature Biotechnology) e uma versão de demonstração do pro- grama podem ser obtidos de //gcrg.ucsd.edu/downloads/fba.html

144 144 Um programa interativo de demons- tração (FBA/MOMA) para E. coli, computa fluxos metabólicos e pos- sibilta prever efeitos resultantes da supressão de gene(s). Pode ser usado em: //atlas.med.harvard.edu/moma/

145 145 Leitura sugerida: Palsson, B.O. Systems Biology- Properties of Reconstructed Networks. Cambridge University Press Stephanopoulos, G.N.,Aristidou. A.A.,Nielsen, J. Metabolic Engineering. Academic Press Meyer,C.D. Matrix analysis and applied linear algebra. SIAM. Philadelphia Boldrini, J.L. et al. Álgebra Linear. Harper & Row do Brasil(editora Harbra Ltda.).3a.ed Campbell, H.G. Matrices with Applications.Mere- dith Corp. New York


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