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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE FARMÁCIA AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE NANOPARTÍCULAS Prof. Rilton Alves de Freitas Centro.

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1 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE FARMÁCIA AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE NANOPARTÍCULAS Prof. Rilton Alves de Freitas Centro e Ciência da Saúde, Universidade do Vale do Itajai, Itajai-S.C., Brasil Aula curso Second Brazilian School on Nanobiotechnology-Itajai-S.C de Novembro 2007 (rede de nanobiotecnologia-NANOBIOTEC

2 ASPECTOS GERAIS DE NANOPARTÍCULAS Fatores de toxicidade de nanopartículas (Nighswonger, 1999; Oberdörster et al., 2005; Smart et al. 2005):: -Como citado anteriormente a razão área superficial pela massa, pois uma grande área superficial gera partículas com uma maior área de contato com membranas células, assim como uma grande capacidade de absorção e transporte de substâncias tóxicas. -O Tempo de retenção da partícula, pois quanto maior o tempo de contato da mesma com a membrana celular, maior a chance de dano. Este fator incorpora o conceito de mobilidade de partícula, ou pelo clearance ou migração para tecidos adjacentes. -Reatividade ou toxicidade inerente do composto químico contido com a partícula.

3 ASPECTOS GERAIS DE NANOFIBRAS Tamanho da fibra x respirabilidade (capacidade de penetrar na região centro-acinar do pulmão). – Fibras com comprimento maior que 15 um apenas são respiráveis se apresentam uma espessura menor que 5 um. –Fibras longas (>17 um) tornam difícil a fagocitose por macrófagos, promovendo uma resposta crônica que contribui para a fibrose pulmonar. –Fibras curtas, menores que 7 um, são por outro lado facilmente fagocidadas, e removidas por macrófagos alveolares (DONALDSON e TRAN, 2004; YE et al., 1999; DONALDSON et al., 1992). A Biopersistência: partículas longas são dificilmente fagocitadas por macrófagos. –Fibras biosolúveis são capazes de se difundir reduzindo e serem fagocitadas mas facilmente, gerando uma baixa biopersistência e reduzindo assim a toxicidade de fibras longas longas (maiores que 20 um). Reatividade ou toxicidade inerente, dependendo basicamente dos componentes químicos da nanopartículas.

4 REGULAMENTAÇÃO DA NANOTOXICOLOGIA AVALIAÇÃO COMPLETA DO RISCO DE PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS (Friedrichs, Schulte, 2007) –Identificação do risco –Caracterização do risco –Avaliação do risco –Prevenção e controle o risco –Avaliação das medidas de controle do Obs:. Royal Society and the Royal Academy of Engineering of UK government, Recommend nanoparticulate materials to be treated as new substances.

5 Tempo para desenvolver um medicamento a selecionados 250 entram em teste pré-clínico Apenas 1 chega ao mercado Anos Invenção e desenvolvimento Testes pré-clínicos (testes laboratoriais em animais) Fase I – 20 a 80 voluntários saudáveis para determinar segurança e dosagem Fase II – 100 a 300 voluntários para determinar eficácia e efeitos colaterais Fase III – a pacientes voluntários para monitorar reações adversas em uso de longa duração Aprovação do Governo Fase IV – Teste adicional pós-comercialização PatentesolicitadaPatenteconcedida 5 entram em testes clínicos

6 Avaliação toxicológica – Estudos Pré- clínicos Estudos Agudos DL50 Oral DL50 Dérmica CL50 Inalatória Irritação / Corrosão Ocular Irritação / Corrosão Dérmica Sensibilização Cutânea Avaliação de perigo Classificação toxicológica

7 Avaliação toxicológica Estudos sobre mutagenicidade Mutação gênica (procariontes) Mutação cromossômica (eucariontes) Estudos sobre carcinogenicidade Camundongo (18 meses) Rato (24 meses) Estudos sobre teratogenicidade Coelho Rato Proibição do Registro

8 Estudos de reprodução e prole Estudos de curto prazo Roedor (90 dias) Não roedor (1 ano) Avaliação toxicológica Estudos de longo prazo e carcino Camundongo (18 meses) Rato (24 meses) Estudos dos efeitos teratogênicos Estudos de neurotoxicidade NOAEL

9 Ingestão Diária Aceitável (IDA) - quantidade máxima que, ingerida diariamente durante toda a vida, parece não oferecer risco apreciável à saúde, à luz dos conhecimentos atuais Definições importantes

10 Avaliação toxicológica Dose 3X Controle Dose 2X Dose X NOAEL

11 Avaliação toxicológica NOAEL IDA = NOAEL Fator de incerteza Fatores de incerteza

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13 TESTES PRÉ-CLÍNICOS: MÉTODOS TOXICOLOGICOS IN VITRO Azul de tripan

14 QUANTIFICAÇÃO DE CRESCIMENTO MTT (3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

15 ApoptosisNecrosis Alaranjado de Acridina AO stains DNA Small intense spots Diffuse spots

16 Processos necróticos: Lactato desidrogenase LACTATOPIRUVATO NAD+ NADH

17 Processos terminais –Nucleases: Fragmentação do DNA –Morfologia (nuclear) Processos iniciais –Fosfatidilserina –Caspases QUANTIFICAÇÃO APOPTOSE

18 DAPI TUNEL/IODETO PROPIDIO BROMETO DE ETIDIO ALARANJADO DE ACRIDINA

19 Células saudáveis –Membrana polarizada DAPI –Sistema de transporte ativo (Azul 460 nm) Células vitais –Membrana polarizadaBROMETO DE ETIDIO –Sem sistema de transporte ativo(Vermelho 602 nm) Células intactas –Membrana despolarizada BROMETO DE ETIDIO –Sem sistema de transporte ativo(Vermelho 602 nm) Células mortas –Membrana despolarizada BROMETO DE ETIDIO –Sem sistema de transporte ativoIODETO PROPIDIO (Vermelho 603 nm)

20 Annexine-FITC normal early late + PI

21 Espalhamento (Forma, Granulos) size Fluorescence Verde (FITC) Fluorescence Vermelho (PI) Citometria de Fluxo

22 Dados Típicos Forward scatter Espalhamento frontal Side scatter Espalhamento lateral Forward scatter Side scatter

23 Annexine-FITC PI Early apoptotic Late apoptotic Necrotic Viable ? PI vs. Annexin-FITC)

24 Propidium iodide = DNA BRdU = Sintese DNA Ciclo celular + corantes G1G1 S G2G2 M Apoptose S=DNA synthesis M=cell divides G = gap Losing DNA

25 G 2 /M G1G1 S O Red fluorescence Green G 2 /M G1G1 S O Red fluorescence Green Higher dilution rate Lower death Lower dilution rate Higher death

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27 CASPASE -3 WESTERN BLOT OU IMMUNOBLOT

28 FRAGMENTAÇÃO DNA

29 Células Caco-2 culture dish insert Basolateral medium apical medium Caco-2 cell monolayer MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA BIODISPONIBILIDADE IN VITRO DE NANOPARTÍCULAS

30 Célula Caco-2 Meio E-MEM 10% SFB células/mL Matriz extracelular Permeação aparente (Papp) Porção apical Incubação 14 – 28 dias 37oC/5%CO 2 TEER 350 *cm2 Baso Lateral Tempos 0 – 24 horas Intervalo 2h

31 CLASSIFICAÇÃO BIOFARMACÊUTICA Solubilidade e Permeabilidade são os parâmetros chaves que controlam a absorção de fármacos (AMIDON, 1995) Classe I: Fármacos de alta solubilidade e alta permeabilidade; Classe II: Fármacos de baixa solubilidade e alta permeabilidade; Classe III: Fármacos de alta solubilidade e baixa permeabilidade; Classe IV: Fármacos de baixa solubilidade e baixa permeabilidade

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36 TEER: Resistência Elétrica Transepitelial > 300 cm 2 < 300 cm2 Manitol

37 Apical Basal enterocito

38 APICAL * CYP3A4 BASAL enterocito

39 APICAL CYP3A4 BASAL enterocito * X

40 APICAL BASAL enterocito *

41 APICAL BASAL enterocito Pgp CYP3A4 OAT P

42 BIODISPONIBILIDADE Classificação do fármaco segundo o Sistema de Classificação Biofarmacêutico. Classe P app Razão dose/solubilidade 1 Altamente solúveis e altamente permeáveis > < ou = 0,5 2 Baixa solubilidade e alta permeabilidade > > 0,5 3 Alta solubilidade e baixa permeabiliade < 2 x < ou = 0,5 4 baixa solubilidade e baixa permeabilidade < 2 x > 1 TEMPO (h) Conc. Basal tg

43 P app > cm/s: 100% absorvido < P app < cm/s: 1 – 99% absorção P app < cm/s: < 1 % absorção Bioequivalência: Alta permeabilidade P app > cm/s Baixa permeabilidade P app < cm/s

44 TESTES PRÉ-CLÍNICOS: TESTES TOXICOLÓGICOS IN VIVO

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49 Acridinas = intercalantes Levam a mudança de fase de leitura Dímero de pirimidina Lesão mais comum do UV curto (fotoliase) Nem sempre a droga é mutagênica Aflatoxina do fungo do amendoim é ativada perto do núcleo 4. MUTAGÊNESE (GENOTOXICIDADE) E CARCINOGÊNESE

50 Reparo de erros de pareamento Mismatch repair Teste de AMES 10 bilhões de Salmonella his- Uma reversão de mutação torna-as his+ Expansão de repetições Huntintina expande de 6-31 rep. para 36-82

51 GENOTOXICIDADE Camundongo Fêmur Remoção das epífises 1) Contagem câmara de Neubauer 2) Viabilidade 85% 3) cel/mL Lâminas Jateadas Agarose 1% Agarose Low melting 0,75% Incubar 1h 37 C/5%CO 2 Controles DMSO MMS ou H 2 O 2 Lavar com PBS gelado

52 Tampão de lise Tampão de corrida 25 V 300 mA 30 min Tampão de Neutralização Brometo de etídeo DMSO: Núcleo íntegro (controle NEGATIVO de Genotoxicidade) MMS: Fragmentação nuclear (controle POSITIVO de Genotoxicidade)

53 Método de classificação de Kobayashi et al. (1995); Miyamae et al. (1998) 1)sem cauda 2) cometas com pequenas caudas (caudas com comprimento < 25% da cabeça) 3) Cometas com caudas de tamanho médio (caudas com comprimento entre 25% e 100% da cabeça) 4) Cometas com caudas longas (comprimento da cauda > que a cabeça) 5) Cometas mal definidos ou com cabeça pequena.

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