Fator nuclear kappa B: cadeia leve kappa de moleculas de anticorpos dos linfócitos B. Respostas inflamatórias, estresse oxidativo, TNF alfa citocinas.

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1 Fator nuclear kappa B: cadeia leve kappa de moleculas de anticorpos dos linfócitos B.
Respostas inflamatórias, estresse oxidativo, TNF alfa citocinas

2 Miostatina Se-Jin Lee (1997)  Mstn (-/-) 30% mais pesados

3 Miostatina Se-Jin Lee (1997)  Mstn (-/-) 30% mais pesados

4 Miostatina Se-Jin Lee (1997)  Mstn (-/-) 30% mais pesados A B
Phenotype of mysotatin null vertebrates.A: upper forelimb muscles of wild-type mouse; B: upper forelimb of mouse that is myostatin null Copyright permissions: copyright 1997 National Academy of Sciences

5 Miostatina No mesmo ano, fenótipo “Double-muscle”

6 Miostatina 2004  Primeiro caso em humanos descrito: menino alemão

7 Miostatina Miostatina ou GDF-8 pertence TGF-β 12kDa na forma ativa
Forma ativa Dímero ligado por duas pontes de sulfeto

8 Miostatina Encontrada no plasma, músculo e tecido adiposo
Efeito parácrino e autócrino. Hormonal? Regulador negativo do crescimento muscular

9 Miostatina

10 Miostatina

11 Miostatina

12 Miostatina

13 Miostatina

14 Miostatina

15 Miostatina Hiperplasia Hipertrofia
X Estágios iniciais  modelos nocautes

16 Miostatina Hiperplasia Hipertrofia
X Tratamento com anticorpo contra miostatina  camundongos de 29 semanas de idade

17 Miostatina Hiperplasia  desenvolvimento embrionário, determinando o número total de fibras Hipertrofia  pós-embrionário e pós-natal, determinando o diâmetro da fibra

18 Miostatina Mecanismos de ação propostos: Controle do ciclo celular:
-> Células satélites: a miostatina inibiria atividade. -> Diferenciação dos mioblastos: inibição Myo D e miogenina preveniria a saída do ciclo. Perda da capacidade de maturação. The hypertrophic effect of myostatin inhibition could in part result from inhibition of the activity of satellite cells, the normally quiescent muscle stem cells (Charge & Rudnicki, 2004). In addition to acting as precursor cells for regeneration processes in relation to muscle cell injury, satellite cells have been more recently demonstrated to also respond to physiological loading of muscle and to fuse with existing myofibers to provide new myonuclei during muscle hypertrophy development (Kadi & Thornell, 2000). Myofibers develop from myoblast that by fusion give rise to myotubes, which eventually de- velop into mature multinucleated skeletal muscle fibers in the process of myogenesis (Charge & Rudnicki, 2004).

19 Miostatina p21 Modificado de Alberts et al. 2004
The hypertrophic effect of myostatin inhibition could in part result from inhibition of the activity of satellite cells, the normally quiescent muscle stem cells (Charge & Rudnicki, 2004). In addition to acting as precursor cells for regeneration processes in relation to muscle cell injury, satellite cells have been more recently demonstrated to also respond to physiological loading of muscle and to fuse with existing myofibers to provide new myonuclei during muscle hypertrophy development (Kadi & Thornell, 2000). Myofibers develop from myoblast that by fusion give rise to myotubes, which eventually de- velop into mature multinucleated skeletal muscle fibers in the process of myogenesis (Charge & Rudnicki, 2004). Modificado de Alberts et al. 2004

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21 Objetivos Condições atróficas (AIDS, atrofia induzida pelo desuso, imobilização, tratamento com glicocorticóides, suspensão das patas posteriores, “space flight”) Uma vez que a miostatina encontra-se com sua expressão aumentada em situações...

22 Objetivos Modelos “in vivo” e “in vitro” de caquexia induzida pela miostatina para identificar mecanismos e vias pelos quais esta proteína atuaria. Este trabalho propoe:

23 Materiais e Métodos Atrofia “in vitro”
 C2C12: 72h no meio de diferenciação/ 24h no mesmo meio (0 ou 10 µg/ml Mstn). Análise do diâmetro miotubular. Atrofia “in vivo”  “Athymic nude mice”: Machos 4 semanas; injeções de CHO no quadriceps femoris; utilização depois de 30 dias.

24 Materiais e Métodos Transfecção C2C12 com pax3 e MyoD (luciferase gene reporter) Nothern/ RT-PCR Microarray Western blot FoxO1 siRNA e linhagem C2C12 expressando inibidor de NF-kB (IkBα)

25 Resultados Redução do diâmetro - Dose dependente
O que estaria acontecendo no desenvolvimento dos mioblastos na presença da miostatina??

26 Resultados MyoD : fator de transcrição miogênico, crítico na diferenciação do músculo esquelético e essencial no reparo destas fibras. Pax3: Fator de transcrição relacionado com o desenvolvimento muscular, diferenciação e estabelecimento dos miotubos. myoD: regulador da sintese de proteinas importantes na miogenese muscular e regeneração  musculos atroficos devido a tumores apresentam uma baixa expressoa desta proteina e possivelmente a via TNF alpha nf-kB esta envolvida. Pax3: desenvolvimento das celulas precursoras dos mioblastos. Localiza-se acima geneticamente do gene myoD, possivelmente pode influenciar a sua expressão.

27 Resultados In vitro – pax3: ↓52% In vivo – pax3: ↓30% MyoD:↓84%

28 Resultados In vitro – pax3: ↓52% In vivo – pax3: ↓30% MyoD:↓84%

29 Resultados Miostatina atua prevenindo o crescimento muscular pela regulação da expressão de MyoD diretamente ou por meio de pax3 . Como eu disse, o gene pax3 esta localizado acima do myod

30 Resultados Como MyoD é alvo de inibição por NF-kB,
Será que miostatina sinalizaria por esta via?

31 Resultados In vitro – Não ocorreu alteração de NF-kB nuclear
Células IkBα - Atrogin-1:↑110%

32 Resultados In vitro – Não ocorreu alteração de NF-kB nuclear
Células IkBα - Atrogin-1:↑110%

33 Resultados Portanto, miostatina parece atuar independente de NF-kB

34 Resultados Será que a miostatina altera a degradação de proteínas? Qual o mecanismo? Partindo para o estudo da degradação de proteínas...nos vimos ate agora que a miostatina provavelmente atua inibindo o crescimento muscular pela inibição da diferenciação e desenvolvimento da fibra bem como da regeneração e recrutamento das células satélites.

35 Resultados In vitro – E2: ↑90% Atrogin-1: ↑60%
MuRF-1: não houve diferença! In vivo – E2: não houve diferença! Atrogin-1: ↑150% ¨ MuRF-1: ↑ 58%

36 Resultados In vitro – E2: ↑90% Atrogin-1: ↑60%
MuRF-1: não houve diferença! In vivo – E2: não houve diferença! Atrogin-1: ↑150% ¨ MuRF-1: ↑ 58%

37 Resultados In vitro – ↑60% proteínas ubiquitinadas
Evidência de ativação do sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma Mas qual seria a via de ativação destes atrogenes?

38 Resultados In vitro – ↑60% proteínas ubiquitinadas
Evidência de ativação do sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma Mas qual seria a via de ativação destes atrogenes?

39 Resultados In vitro – ↑60% proteínas ubiquitinadas
Evidência de ativação do sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma Mas qual seria a via de ativação destes atrogenes?

40 Resultados In vitro – aumento na expressão de FoxO1 dependente da concentração de miostatina In vivo – ↑ 650% na expressão de FoxO1

41 Resultados In vitro – Reduz a quantidade de p-FoxO1 e p-Akt.
Portanto, acredita-se que a miostatina influencia a via pi3K/akt/foxo1 diminuindo os níveis de foxo1-p, fazendo com que esta se concentre no nucleo atuando como fator de transcrição para os atrogenes.

42 Resultados Portanto, acredita-se que a miostatina influencia a via pi3K/akt/foxo1 diminuindo os níveis de foxo1-p, fazendo com que esta se concentre no nucleo atuando como fator de transcrição para os atrogenes.

43 Resultados Portanto, acredita-se que a miostatina influencia a via pi3K/akt/foxo1 diminuindo os níveis de foxo1-p, fazendo com que esta se concentre no nucleo atuando como fator de transcrição para os atrogenes.

44 Resultados Portanto, acredita-se que a miostatina influencia a via pi3K/akt/foxo1 diminuindo os níveis de foxo1-p, fazendo com que esta se concentre no nucleo atuando como fator de transcrição para os atrogenes.

45 Conclusões Miostatina parece induzir a caquexia bloqueando a síntese de proteínas chaves no desenvolvimento e maturação da fibra muscular e, ainda, ativando o sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma. Atua de forma independente da sinalização TNF-α e NF-kB. Antagoniza a hipertrofia causada pela via PI3K/Akt/FoxO1.