O desenvolvimento de protocolos ideais para conservação de folículos pré-antrais é o primeiro passo para a obtenção e manipulação de milhares de folículos.

Apresentação em tema: "O desenvolvimento de protocolos ideais para conservação de folículos pré-antrais é o primeiro passo para a obtenção e manipulação de milhares de folículos."— Transcrição da apresentação:

1 O desenvolvimento de protocolos ideais para conservação de folículos pré-antrais é o primeiro passo para a obtenção e manipulação de milhares de folículos presentes nos ovários de animais, vivos ou mortos. As condições de transporte até o laboratório são cruciais para viabilizar todas as etapas posteriores da biotecnologia dos gametas femininos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o impacto das variáveis temperatura, meios de cultura e tempo pós-colheita sobre a viabilidade de folículos ovarianos pré-antrais conservados in situ na espécie equina. Ovários (n = 10) oriundos de éguas (n=10) de diversas raças em anestro estacional foram obtidos em frigorífico de eqüinos, distante 120 km do laboratório. Imediatamente após a morte dos animais, os ovários foram lavados em álcool 70% e em solução salina 0,9% por 10 segundos e então dissecados, dividindo a porção cortical (mais interna) em 19 fragmentos de aproximadamente 3 x 3 x 1 mm. Um fragmento de cada ovário foi imediatamente fixado em Carnoy por 24 h como controle (T1). Os outros 18 foram distribuídos em tubos contendo 10 ml de MEM (Meio Esssencial Mínimo) ou PBS (Phosphate- bufferid saline) a 4, 20 ou 39º C e conservados por 4, 12 ou 24 horas (figura 1). A avaliação foi realizada em todos os tratamentos através de histologia clássica e coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) - hematoxilina. A análise prévia dos resultados mostrou que a temperatura parece ser mais importante do que o meio de conservação. Na temperatura de 4 graus, independentemente do meio utilizado (MEM ou PBS), os folículos mostraram-se bem conservados, com tendência a um maior percentual de degeneração conforme o intervalo de tempo aumentava. Nas temperaturas de 20º e 39ºC observou-se alto grau de degeneração em todos os tempos e meios estudados. Este trabalho mostra como resultados preliminares que foliculos ovarianos apresentaram-se morfologicamente normais quando coservados in situ em MEM ou PBS a 4ºC por 4 horas. ANDRADE, E. R.; RODRIGUES, A. P. R.; AMORIM, C. A.; CARVALHO, F. C. A.; DODE, M. A. N.; FIGUEIREDO, J. R. Short- term maintenance of sheep preantral follicles in situ in 0,9% saline and Braun Collins solutions. Small Ruminant Research. v. 41, n. 2, p.141-149, 2001. ANDRADE, E. R.; AMORIM, C. A.; COSTA, S. H. F.; FERREIRA, M. A. L.; RODRIGUES, A. P. R.; DODE, M. A. N.; FIGUEIREDO, J. R. Preliminary study of short-term preservation of ovine ovarian tissue containing preantral follicles in saline solution or TCM199. Veterinary Record. v. 151, p. 452-53, 2002. CECCONI, S.; BARBONI, B.; COCCIA, M. & MATTIOLI, M. In vitro development of sheep preantral follicles. Biol. Reprod., v.60, p.594-601, 1999. FIGUEIREDO, J.R.; HULSHOF, S.C.J.; THIRY, M.; VAN DEN HURK, R.; BEVERS, M.M.; NUSGENS, B. AND BECKERS, J.F. Extracellular matrix proteins and basement membrane: their identification in bovine ovaries and significance for the attachment of cultured preantral follicles. Theriogenology, v. 43, p. 845-858, 1995. LOPES, C. P.; SANTOS, R. R.;CELESTINO, J, J. H,; MELO, M. A. P.; CHAVES, R. N.; CAMPELLO, C. C.;SILVA, J. R. V.;BÁO, S. N.; JEWGENOWB, K.; FIGUEIREDO, J. R. Short-term preservation of canine preantral follicles: Effects of temperature, medium and time. Animal Reproduction Science. V. 115, p. 201-214, 2009. LUCCI, C.M.; AMORIM, C.A.; RODRIGUES, A.P.; FIGUEIREDO, J.R.; BAO, S.N.; SILVA, J.R.; GONCALVES, P.B. Study of preantral follicle population in situ and after mechanical isolation from caprine ovaries at different reproductive stages. Anim Reprod Sci., v.56(3-4), p.223-36, 1999. LUCCI, C. M.; KACINSKIS, M. A.; RUMPF, R.; BAO, S. N. Effect of lwered temperatures and media on short-term preservation of zebu (Bos indicus) preantral ovarian follicles. Theriogenology. v. 61, p. 461-72, 2004. LUCCI, C. M.; SHREIER, L. L.; MACHADO, G. M.; AMORIM, C. A.; BAO, S. N.; DOBRINSKY, J. R. Effects of storing pig ovaries at 4 or 20 o C for different periods of time on the morphology and viability of pre-antral follicles. Reprod. Dom. Anim. v. 42, p. 76–82, 2007. NAVES, C. S.; VIEIRA, R. C.; DINIZ, E. G.; JACOMINI, J. O.; BELLETI, M. E.; OLIVEIRA, R. C. Desenvolvimento morfológico dos ovários em fetos equinos sem raça definida. Ciência Rural. v. 38, n. 2, p. 416-22, 2008. SZLACHTA, M.; TISCHNER, M. Distribution, morphology and ultrastructure of preantral follicles in the ovary of the mare. Havemeyer Foundation Monograph Series N. 5, p. 33-35, 2008. TELFER, E.E. The Development of Methods for Isolation and Culture of Preantral Follicles from Bovine and Porcine Ovaries. Theriogenology, v. 45, p. 101-110, 1996. VAN DEN HURK, R.; BEVERS, M. M.; BECKER, J. F. In vivo and in vitro development of preantral follicles. Theriogenology, v.47, p.73-82, 1997. EFEITO DO TEMPO, TEMPERATURA E MEIOS SOBRE A VIABILIDADE FOLICULAR NA ESPÉCIE EQUINA – Resultados preliminares. Autores: Roberta G. Gomes1; Evelyn R. Andrade2; Marcelo M. Seneda1* 1- Professor(a) do Departamento de Clínicas Veterinárias - CCA/UEL, Londrina PR 2- Bolsista PRODOC/CAPS E-mail: mseneda@uel.br *mseneda@uel.br Introdução Material e Métodos Conclusão Resultados Universidade Estadual de Londrina – Centro de Ciências Agrárias - Departamento de Clínicas Veterinárias Referências De acordo com nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho a relatar uma estratégia viável de transporte de ovários equinos, considerando tempo, meios e temperaturas. A partir dos resultados deste experimento, torna-se possível uma utilização mais eficiente dos folículos primordiais da espécie equina, com aproveitamento de milhares de folículos primordiais para as biotécnicas de cultivo folicular, FIV e clonagem. As perspectivas de tais biotécnicas são altamente promissoras, considerando-se a obtenção de blastocistos ovinos a partir do cultivo de folículos pré-antrais. Ressalta-se, ainda, a importância de uma melhor compreensão da fisiologia folicular para a espécie equina, considerando-se a escassez de ovários de égua disponíveis para trabalhos experimentais. Discussão 18 fragmentos 19 fragmentos + 1 fragmento (T1 – Tempo 0) 4h 12h 24h 4h 12h 24h 4h 12h 24h 4h 12h 24h 4h 12h 24h 4h 12h 24h (T2) (T3) (T4) (T5) (T6) (T7) (T8) (T9) (T10) (T11) (T12) (T13) (T14) (T15) (T16) (T17) (T18) (T19) 4º C 20º C 39º C Incubação PBS MEM Figura 1. Delineamento experimental para preservação de folículos pré-antrais de ovários eqüinos.