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Acervo (representando espécies e variantes genéticos de Leishmania do Novo Mundo): 2.500 estoques criopreservados em diversos intervalos de tempo desde.

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1 Acervo (representando espécies e variantes genéticos de Leishmania do Novo Mundo): estoques criopreservados em diversos intervalos de tempo desde Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz Leishmania Type Culture Collection (WDCM) Laboratório de Pesquisas em Leishmaniose (Departamento de Imunologia/IOC) Centro de referência (WHO International Leishmania Reference Strain Center e SVS/MS) FIOCRUZ

2 Equipe Curadores - Elisa Cupolillo (PhD) e Gabriel Grimaldi (PhD) Luiz Eduardo de Carvalho Paes – Tecnologista, BSc Ângela Cristina Volpini – Tecnologista, PhD Lilia Macedo Firoozmand – Tecnologista, BSc Adriana Gaspar – Apoio Técnico FIOCRUZ

3 Serviços prestados: Consultorias Formação de pessoal Depósito (guarda) de amostras Fornecimento, gratuito, de cepas de referência de Leishmania para grupos de pesquisas do Brasil e do exterior Tipagem bioquímica e molecular de amostras e isolados FIOCRUZ

4 Perfil da coleção de Leishmania do IOC Trabalhos em colaboração com vários pesquisadores na América Latina Depósito de cepas de outros laboratórios, onde eram mantidas em cultura ou criobancos Isolados originais enviados diretamente ao nosso laboratório para identificação e que são depositados. Nos últimos 5 anos, foram coletados mais de isolados, provenientes de diversas áreas endêmicas no Brasil e outros países da América do Sul. FIOCRUZ

5 Catalogação de dados relevantes da coleção Entrada das amostras Cada estoque depositado no Banco recebe um número de identificação (IOC/L), sendo informatizados os dados relevantes sobre o estoque. Os estoques são reconhecidos pelo seu código (WHO 1990), que indica (1) espécie do animal reservatório ou vetor, de onde o parasito foi isolado; (2) país e (3) ano de isolamento; e (4) designação da cepa original Ex.: MHOM/BR/1980/LSP MCHO/CR/1987/356 IFLA/BR/1967/P32 Tipagem Bioquímica e Molecular e Classificação Taxonômica 1.Todas as amostras são classificadas em zimodemas empregando 18 sistemas loci-enzimáticos – IOC/Z 2.Perfis de RFLP dos ITSrDNA estão sendo construídos e adicionados ao banco FIOCRUZ

6 Leishmania -Protozoário unicelular - Flagelado - Heteroxeno - Dimórfico FIGURA 1. AmastigotasFIGURA 2. Promastigotas

7 Adaptado WHO 1990 e Cupolillo et al CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DE Leishmania NO NOVO MUNDO

8 Centro de referência em Leishmania (WDCM 731) -Estoques congelados: (a) Leishmania na forma promastigota (b) A maior parte dos estoques está criopreservados com glicerol 8% - Informatização dos dados e cadastro dos estoques Laboratório de Pesquisas em Leishmaniose/ IOC COLEÇÃO DE Leishmania DO IOC

9 1)Avaliar a estabilidade molecular (identidade) dos parasitos recuperados nas culturas empregando técnicas bioquímicas e moleculares; 2) Estabelecer um padrão ideal do número e forma morfológica dos parasitos a serem novamente criopreservados a fim de garantir amostras viáveis em um futuro descongelamento; 3) Determinar a viabilidade dos parasitos correlacionando com o tempo e condições que se mantiveram criopreservadas; 4) Garantir uma re-criopreservação com sucesso para que mais tarde as amostras ao serem descongeladas se apresentem estáveis e viáveis, isso através do conhecimento de uma faixa ideal do número de parasitas no momento da criopreservação;

10 6-fosfogluconato desidrogenase Nucleosídio Hidrolase Aconitato Hidratase Fumarase Glicose-Fosfo-Isomerase Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase Hexoquinase Isocitrato desidrogenase Malato desidrogenase Enzima Málica Manose-Fosfato-Isomerase Nucleotidase Peptidase Fosfo-Gluco-Mutase Fosfatase Ácida 6PGDH - NH - ACON - FUM - GPI - G6PDH - HK - IDH - MDH - ME - MPI - NH - PEPD - PGM - ACP - Isoenzimas Métodos empregados nos estudos taxonômicos

11 Caracterização por MLEE – várias espécies de Leishmania

12 PCR ITSrDNA Os primers usados: ITS 1(5 GCTGTAGGTGAACCTGCAGCAGCTGGATCATT-3 ) e ITS 2 (5 -GCGGGTAGTCCTGCCAAACACTCAGGTCTG-3 ) SSU 5.8S LSU(1) IR1 IR2 NTS ITS PCR - Produto específico de ITS rDNA Organização estrutural do lócus rRNA. RFLP

13 Classificação e relação filogenética FIOCRUZ

14 viabilidade relacionada ao tempo Viabilidade celular de L (L.) chagasi em relação ao tempo de criopreservação.

15 GLICEROL viabilidade relacionada a solução de congelamento Relação entre o crioprotetor utilizado para a preservação de Leishmania

16 Procedimentos operacionais usados na manutenção e controle de qualidade dos espécimes colecionados: Normas padronizadas - World Federation for Culture Collections (WFCC), American Type Culture Collection (ATCC), Organização Mundial da Saúde (OMS) Manutenção – passagens seriadas Preservação – Nitrogênio líquido Controle de qualidade: tipagem períodica por métodos bioquímicos e moleculares FIOCRUZ


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