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An oxidative stress response to polycyclic aromatic hydrocarbon exposure is rapid and complex in A. thaliana Plant Science, 2009 Cólon-Carmona Lab - University.

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1 An oxidative stress response to polycyclic aromatic hydrocarbon exposure is rapid and complex in A. thaliana Plant Science, 2009 Cólon-Carmona Lab - University of Massachusetts Boston, USA

2 Resumo HPA foram uma classe de compostos orgânicos carcinogênicos cancerígenos e são candidatos atrativos para a fitorremediação Plântulas de Arabidopsis foram tratadas com fenantreno para entender em detalhes os mecanismos de stress oxidativo A atividade de das enzimas antioxidantes SOD, POD, CAT e APX, assim como H2O2, GSH e o produto da oxidação lipídica malondialdehyde (MDA) foram medidos no tecido foliar após 30 dias de tratamento com fenantreno de mM SOD teve sua atividade aumentada CAT permaneceu praticamente inalterada POD e APX exibiram pico em 0.25 mM e declinaram em concentrações mais altas H2O2, GSH e MDA aumentaram com fenantreno e o DAB mostrou-se dose- dependente da acumulação de H2O2

3 Resumo Os níveis de RNAm de APX1 e CAT2 foram medidos em 6 pontos durante 72h de fenantreno a 1mM : APX1 - 48h e CAT2- 12h Os níveis de clorofila a e b caem com o aumento da concentração de fenantreno A microscopia eletrônica de transmissão revelou que cloroplastos e mitocôndrias ficam deformados e estruturam celulares colapsaram Isto mostra que estresse oxidativo é um componente importante da resposta aos HPA em plantas

4 Materiais e Métodos 1.Plantas Fenantreno em metanol 100 mM em MS 1/2 (2% de sacarose, 0,8% de fitoagar, pH 6) em concentrações finais de 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1 e 1.25 mM Esterilização: etanol 75% e 10% de hipoclorito de sódio Ecotipo Columbia - sementes 3d a 4oC e transferidas para 23oC, fotoperíodo16/8h As sementes germinadas foram contadas e o crescimento das plântulas monitorado Os parâmetros fisiológicos foram medidos 30 dias após os experimentos terminados As folhas das plantas foram coletadas no meio do dia, congeladas em N2liq e estocadas a -80oC até o ensaio

5 Materiais e Métodos Para os ensaios de RNAm as plântulas foram crescidas por 11 dias e transferidas para o meio com 1mM de fenantreno ( uso de controle) Os tecidos foliares foram coletados após 4, 6, 8, 12 e 72h de plantas controle e em fenantreno Também coletadas ao meio-dia, congeladas em N2 e estocadas -80oC ? 2. Parâmetros fisiológicos Tecidos foliares (0.2-1g) foram homogenizados mm PBS gelado (50mM pH7) contendo 1% PVP Centrifugados a 10,000 rpm 4oC por 10 min O Sobrenadante foi usado imediatamente para determinar as atividades de SOD, POD, CAT, MDA e proteínas.

6 Materiais e Métodos A atividade de SOD foi determinada por NBT em 560 nm POD: metódo guaiacol (mistura de 3 mL contendo guaiacol 20mM, 100mM PBS, 20uL de H2O2 30% (m/v) e 80uL de extrato enzimático) a 470 nm CAT: perseguindo a diminuição da absorbância a 240 nm ( método UV) MDA: thiobarbituric acid colorimetry (? Hodges 48) Proteína: Comassie blue APX: perseguindo a diminuição da absorbância a 290 nm ( método UV). Folhas (0.5g) foram homogeneizadas em 5 mL de extrato enzimático (pH 7.8) contento 50mM PBS, 15mM EDTA, 12mM ascorbato centrifugação a 8000 rpm a 4oC por 15 min -> o sobrenandante foi utilizado para determinar a atividade de APX Mistura para o ensaio (1mL): 50mM PBS (pH7), 0.1 mM EDTA, 0.5 mM Ascorbato, extrato enzimático e 0.8 mM de H2O2

7 Materiais e Métodos Conteúdo de GSH 0.5g de folha por DTNB (Guo35) Abs a 412nm Conteúdo de clorofila 0.2g de folha (Guo35) Abs a 663, 646 e 470 nm Conteúdo de H2O2 0.5g de folha (Guo35) Absorbância foi medida a 410nm DAB: folhas de 14 dias de estresse foram imersas em solução de DAB (pH7) overnight e descoloridas em etanol 100% por 3h TODOS OS EXPERIMENTOS FORAM REALIZADOS EM QUADRUPLICATA

8 Materiais e Métodos 3. MET Folhas de 16 dias : fixação em gluta, desidratação em série de etanol e lavado em acetona e polimerizados em epon Cortes de 70-80nm e marcados por acetado de uranila e citrato de chumbo Jeol qRT-PCR Extração em trizol cDNA por kit Invitrogen Kit Sybr premix Gene de referência ACT7 Genes CAT2 (?) e APX1 5.Análises estatísticas: 3-25 replicatas (ANOVA- SPSS software)

9 Resultados 1.Efeito nas plântulas Taxa de germinação e tamanho da raiz diminuíram com o tratamento com fenantreno 1mM por mais de 11 dias (Fig1)

10 Resultados Raízes ficaram deformadas e com auxiliares após 30 dias de exposição a fenantreno 0.5mM (dados não mostrados) Os efeitos fisiológicos aumentam com o aumento da concentração de fenantreno (Fig2) Com fenantreno a 1mM algumas plântulas morreram a partir do dia 19

11 Resultados 2. Mudanças no conteúdo de clorofila e na ultraestrutura celular Os níveis de clorofila a e b caíram com o aumento das concentrações de clorofila após 30 dias (Fig3)

12 Resultados Após 16 dias de tratamento com 1mM de fenantreno os cloroplastos perdem a forma e as lamelas se toram menos distintas. Além disso as mitocôndrias e outras organelas não são distinguíveis, consistente com danos membranares Algumas células colapsaram e tanto cloroplastos quanto mitocôndrias não são distinguíveis (Fig4)

13 Resultados 3. Enzimas Figura 5: Plantas com 30d Diferenças significativas da atividade de SOD são detectadas ente 0.75, 1.0 e 1.25mM de fenantreno A atividade de CAT foi essensialmente inalterada, mas sugerindo decaimento Todos os níveis de fenantreno induzem as atividades de POD e APX, com atividade máxima a 0.25mM

14 Resultados

15 4.qRT-PCR CAT2 e APX1 (folhas) foram medidos em 5 pontos entre 0 e 72h com 1mM de fenantreno (Fig6) CAT2 desapareceu com 12h e continuou reprimido APX1 aumenta com 12-24h e atinge seu ponto máximo em 48h

16 Resultados 5.GSH Os níveis de GSH aumentam com a concentração de fenantreno Fig 7

17 Resultados 6. H2O2 Plantas de 30 dias (fig8) DAB: tecidos foliares de 14 dias

18 Resultados 7. MDA Fig8b


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