Avaliação da diversidade microbiana

Apresentação em tema: "Avaliação da diversidade microbiana"— Transcrição da apresentação:

1 Avaliação da diversidade microbiana
(Independentes de cultivo) Técnicas moleculares Expressões da diversidade

2 Avaliação da diversidade microbiana
(métodos independentes de cultivo) Riqueza número de grupos presentes Equitabilidade abundância relativa de cada grupo Técnicas que envolvem ácidos nucléicos (RNA ou DNA). Essas técnicas permitem avaliar diversidade (quem está ali?) O potencial metabólico ou atividade quando genes metabólicos ou seus transcritos sejam usados nas sondas (o que fazem?) Métodos mais diretos e analíticos (como FAME).

3 Dogma Central da Biologia Molecular
Sequências rRNA são extremamente importantes em estudos filogenéticos porque são conservadas (evoluiram lentamente) participando na síntese da estrutura dos ribossomos e de proteínas. rDNA indica os genes que codificam para o RNA ribossômico. A maioria dos genes metabólicos são regulados ao nível da transcrição e podem não ser expressos - potencial metabólico. Se o transcrito do gene é expresso então ele será expresso e seu produto será sintetizado - atividade metabólica.

4 Características dos ácidos nucléicos
Dois tipos de ácidos: RNA e DNA DNA é codificado por 4 blocos intercambiáveis denominados bases: Adenina, Guanina, Citosina e Timina. RNA tem 5 bases diferentes: Adenina, Guanina, Citosina e Uracila.

5 Deoxyribonucleic Acid
Ácido desoxiribonucleico DNA Pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas

6 Gene que codifica para rRNA 16S
Porque os estudos de diversidade usam o rDNA? Gene que codifica para rRNA 16S Cerca de 1500 pb codificam para a subunidade 16S da molécula de RNA. Parte destas sequências são conservadas para a maioria dos seres vivos: -contém o passado metabólico do último ancestral comum. Regiões variáveis são usadas na taxonomia - filogenética

7 rDNA Mapa de variabilidade de SSU rDNA bacteriano
Estrutura primária (sequência) e secundária (laços e dobraduras) ordenam a estrutura terciária (3D) dos ribossomos. Mapa de variabilidade de SSU rDNA bacteriano Vermelho = genes altamente conservados SSU (small subunit) 16S

8 Como se replica o DNA? Abertura da dupla fita via reações químicas simples e reconstituição da outra metade de cada fita por imersão em uma mistura composta pelas quatro bases. Cada base pode se combinar apenas com uma única base complementar. Portanto, uma base na “fita antiga” (+) define qual base pode ocorrer na “fita nova” (-) Dessa forma, após cada abertura da fita, são coletadas do substrato réplicas completas da fita original, exceto quando ocorrer uma mutação. (Complementaridade das bases)

9 Replicação do DNA O crescimento do DNA ocorre na direção de 5' para 3' Vídeo 1 Vídeo2 As duas fitas de DNA estão em direção opostas (anti-paralelas): uma das fitas tem a direção exata da sua síntese (5'---3') enquanto que a outra está invertida (3'---5'). Esta conformação em fitas anti-paralelas leva à necessidade de mecanismos especiais para a replicação do DNA.

10 Reação de amplificação do DNA – PCR (amplificação gênica)
O objetivo é fazer um número elevado de cópias de um gene ou sequência. Células são separadas e lisadas DNA dupla fita é separado em fita única. Iniciadores (primers) são adicionados (pequenos fragmentos de DNA, 2-30 nucleotídios) Primers são segmentos complementares aqueles que flanqueiam a sequência alvo Apenas os segmentos DNA alvo entre os primers serão replicados Cada ciclo térmico de PCR consiste de 3 etapas: Desnaturação do DNA alvo (separação das fitas): 94 °C Anelamento por abaixamento da temperatura: 55 °C Extensão quando primers iniciam a síntese de DNA com uma DNA polimerase: 72 °C Cada ciclo resulta no dobro das sequências alvo (dura cerca de seg). Geralmente usam-se 30 ciclos.

11 Taq polimerase É uma enzima termoestável isolada da bactéria Thermus aquaticus, que habita em regiões hidrotermais. "Taq polimerase" é uma abreviatura de Thermus Aquaticus Polimerase. É geralmente usada no PCR porque é razoavelmente barata e pode suportar as condições da técnica (temperatura de desnaturação).

12 PCR

13 PCR

14 O que fazer com PCR? Amplificar genes 16S rDNA diretamente de amostras ambientais. Usar primers específicos de certos grupos: detecção específica Detectar genes funcionais quando sua sequência é conhecida.

15 Perspectivas - O futuro?
Técnicas independentes de cultivo são essenciais, mas são lentas e trabalhosas. Como torná-las mais rápidas para utilizar em análises de comunidades microbianas? Processador automático Amostras ambientais Diversidade microbiana, atividade, potencial metabólico,... Aumentar automação Uso da robótica Tecnologia de microarranjos de DNA

16 FIM