Caracterização e estudos de expressão dos genes que codificam oxalato descarboxilase e formato desidrogenase dependente de NAD+ no fungo Crinipellis perniciosa.

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1 Caracterização e estudos de expressão dos genes que codificam oxalato descarboxilase e formato desidrogenase dependente de NAD+ no fungo Crinipellis perniciosa. Aluno: Bruno Vaz de Oliveira Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Co-orientadora: Johana Rinconez Pérez

2 Introdução Oxalato: composto intermediário do metabolismo de carboidratos Geralmente encontrado na forma de um sal de cálcio ou magnésio, visto que é um quelante de cátions bivalentes.

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5 Na Vassoura-de-bruxa Ceita et al 2005
Plantas infectadas pelo fungo apresentaram, inicialmente, um aumento no número de cristais de oxalato quando comparadas com plantas sadias; após cerca de 36 dias os cristais de oxalato apresentavam significativa redução e após 45 dias os cristais praticamente desapareceram. Tal consumo dos cristais de oxalato foi relacionado à produção de peróxido de hidrogênio, o qual se concentra ao redor destes cristais.

6 Na Vassoura-de-bruxa O oxalato poderia ser aproveitado pela planta para gerar EROs, as quais estariam envolvidas na sinalização intracelular que culminaria na morte celular programada da vassoura verde Cacaueiros resistentes à Vassoura-de-bruxa não apresentam a formação de cristais de oxalato, contrastando com a presença dos mesmos em plantas suscetíveis.

7 Na Vassoura-de-bruxa

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10 Sclerotinia sclerotiorum
Ascomiceto Homotálico Baixa especificidade de hospedeiro Soja Feijão Ervilha Canola Girassol Tomate Batata

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12 Oxalato durante o processo infeccioso: várias funções

13 Modelo de infecção por S. sclerotiorum

14 Sintomas Folhas murchas Necrose Podridão “úmida” Micélio branco
Esclerótios Pesq. agropec. bras., Brasília, v.34, n.6, p , jun. 1999

15 Fator de patogenicidade essencial
Voltando ao oxalato... Fator de patogenicidade essencial Fungos mutantes para a produção de oxalato incapazes de infectar hospedeiros E se a planta fosse capaz de degradar o oxalato produzido pelo fungo???

16 Tomate e Tabaco Transgênicos
Expressão de uma OXDC do fungo Flammulina velutipes em plantas de tomate e tabaco

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19 Na Vassoura-de-bruxa Inspeção do genoma de Crinipellis perniciosa revelou a presença de um gene com similaridade a uma OXCD de Flammulinna velutipes Análise de ESTs obtidos a partir de bibliotecas cDNA acusou um alto nível de expressão de um gene com similaridade a uma formato desidrogenase dependente de NAD+

20 Objetivos Caracterização dos genes que codificam a oxalato descarboxilase (OXDC) e a formato desidrogenase dependente de NAD+ (FDH-NAD) obtenção e análise de sua seqüência completa análise de sua expressão em diferentes condições de cultivo in vitro

21 Justificativa Evidências sugerindo o envolvimento do oxalato com a fitopatogenicidade por C. perniciosa Superexpressão do gene que codifica a formato desidrogenase dependente de NAD+ nas biliotecas do micélio crescido em extrato de cacau Ambas as vias estão de fato relacionadas?? Possível desenvolvimento de cacau transgênico resistente a C. perniciosa, expressando a oxalato descarboxilase.

22 Resultados - Sequenciamento

23 Resultados - Sequenciamento

24 Resultados - Sequenciamento
Teste dos primers para os genes OXDC e FDH. 1) Ladder lamda; 2) Controle (primers para beta-actina); 3) Primers OXDC 1 e OXDC 3; 4) Primers OXDC1 e OXDC 4; 5) Primers FDH 1 e FDH 2; 6) Primers FDH 1 e FDH 4; 7) Primers FDH 2 e FDH 3; 8) Primers FDH 2 e FDH 4.

25 Resultados - Sequenciamento

26 Resultados - Sequenciamento
Clones - OXDC Clones - FDH

27 Resultados - Sequenciamento

28 Resultados - Sequenciamento

29 Resultados - Sequenciamento
PCR – Fragmentos da OXDC

30 Resultados - Sequenciamento
PCR – Fragmentos da FDH

31 Resultados - Sequenciamento
Purificação dos fragmentos Reação de sequenciamento  3 tentativas sem sucesso Clonagem no plasmídeo PGEM Teasy e nova tentativa de sequenciamento Seqüência a partir do cDNA

32 Resultados Meio Mínimo Oxalato 1 mM Oxalato 10 mM Formato 5 mM
Metanol 0,5% Metanol 1 % Metanol 2%

33 Resultados 1) Meio mínimo; 2) oxalato 1 mM; 3) Indução com oxalato 50 mM por 2 horas; 4) formato 50 mM; 5) metanol 2%, 6) Peróxido 1 mM; 7) Extrato de cacau susceptível a C. perniciosa; 8) Extrato de cacau resistente a C. perniciosa;

34 Próximos passos Nova extração de RNA
Hibridização do RNA com as sondas dos genes OXDC e FDH Sequenciamento a partir do plasmídeo PGEM Teasy Caracterização da oxaloacetase