A BIOTECNOLOGIA E O DOSEAMENTO DE SUSPENSÕES CELULARES NA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS. (PUIC ) Ciências A grárias Gilmar Pezzopane Plá, Elisa Sorato Catâneo,

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1 A BIOTECNOLOGIA E O DOSEAMENTO DE SUSPENSÕES CELULARES NA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS. (PUIC ) Ciências A grárias Gilmar Pezzopane Plá, Elisa Sorato Catâneo, Débora Rodrigues e Eulinor Pereira da Silva ( PUIC Continuado). Curso de Agronomia – Campus Tubarão. Introdução Na biotecnologia, um dos ramos da biologia, a área ou a técnica de cultura de tecidos in vitro de plantas permite a regeneração rápida em massa, a partir de explantes, de plantas previamente selecionadas. A aplicação dessas técnicas, tais como a cultura de tecidos vegetais in vitro para a multiplicação e produção de mudas a partir de explantes vegetativos, representam um enorme potencial a ser explorado. Assim o desenvolvimento de mudas de plantas, como as medicinais, que tenham capacidade de produzir quantidades adequadas de princípios ativos para aplicação na área da fitoterapia tradicional ou na produção de derivados como tinturas, extratos líquidos e extratos secos para utilização na produção de medicamentos fitoterápicos pela industria farmacêutica, é um espaço científico pouco explorado. Com a grande biodiversidade de plantas que a região sul de Santa Catarina possui existe a necessidade de explorarmos estas potencialidades, criando bancos de mudas que possam produzir matéria prima vegetal de qualidade aceitável no mercado nacional e internacional. Assim, o desenvolvimento de atividades práticas e de pesquisa ao longo da disciplina de Agrobiotecnologia, a qual tornou-se um PUIC-Disciplina em 2005/2006, passou a ser PUIC-Continuidade em 2006/2007 e 2007/2008, possibilitou aos acadêmicos, por exemplo, experiências que permitiram o entendimento sobre o isolamento e manutenção de culturas axênicas, sendo estas as primeiras etapas na busca de alternativas para a conservação de germoplasma, e a multiplicação massal de várias espécies vegetais de interesse econômico do homem. Portanto, a continuidade dos trabalhos desenvolvidos nos três últimos anos nesta área são muito importantes para a consolidação da área biotecnológica, mais especificamente no cultivo in vitro de espécies frutíferas, ornamentais e medicinais no curso de Agronomia da UNISUL. Para intensificar e diversificar os trabalhos de pesquisa na área de Agrobiotecnologia, estamos desenvolvendo estudos de doseamento de princípio ativos de determinadas plantas medicinais utilizadas em projetos ligados a PIBIC, PUIC-individuais e PUIC continuado, e Trabalhos de Conclusão de Cursos(TCC), onde trabalhamos com o isolamento e doseamento dos derivados do ácido rosmarinico em plantas de melissa. Portanto esta pesquisa teve como principal objetivo proporcionar os alunos o conhecimento das possibilidades de utilização e manipulação de espécies vegetais, trabalhando-se a técnica do cultivo in vitro de plantas e doseamento de suspensões celulares em plantas medicinais. Objetivo Proporcionar os alunos o conhecimento das possibilidades de utilização e manipulação de espécies vegetais, trabalhando-se a técnica do cultivo in vitro de plantas e doseamento de suspensões celulares em plantas medicinais. Metodologia Os ensaios foram realizados Laboratório de Produção Vegetal no Centro Tecnológico – CENTEC, da Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL. Foram utilizados como explantes segmentos nodais e apicais (1cm) das plantas de hortelã (Mentha viridis) cultivadas in vitro. # Multiplicação in vitro: Os segmentos nodais resultantes das brotações das gemas isoladas, e contendo 2 gemas axilares, foram subculturados no meio de cultura descrito anteriormente, acrescido de diferentes concentrações de BAP (6-benzilaminopurina) e AIB (Ácido Indol Butírico). # Doseamento do principio ativo As plantas, no caso a hortelã, após o isolamento e multiplicação, com 90 dias de cultura in vitro foram avaliadas quanto ao número de folhas e de raízes (se houver), comprimento do caule e de raízes (se houver), medidos com um paquímetro manual. A determinação da biomassa seca foi realizada com a pesagem das partes da planta que permaneceram em estufa por 48 horas a 70 Cº. Cada unidade experimental foi constituída de 10 plantas e cinco repetições. Para os experimentos de desenvolvimento das plantas, foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Student-Newman-Keuls (SNK) a 5% de probabilidade. Para o doseamento do teor de certos princípios ativos foram utilizadas amostras (folhas) de todos os tratamentos em questão no PUIC-individual e Continuado. A análise foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência ou espectrofotometria UV-Vis (CLAE), no Centro Tecnológico da UNISUL – CENTEC. Os resultados do doseamento foram cruzados com os dados de pH e nutrientes (meios) e condições climáticas com o objetivo de avaliar as melhores caracteristícas para o desenvolvimento das plantas associado a performance de produção de princípios ativos. Obs: o desenvolvimento metodológico da pesquisa/práticas na disciplina de Agrobiotecnologia ocorreu a partir da sequência das aulas práticas desenvolvidas ao longo dos semestres 2008/A e 2008/B.. Resultados Os resultados cromatográficos foram cruzados com os valores de mentol obtidos a partir da curva de calibração de mentol padrão, a fim de quantificar as amostras. Em todas as amostras analisadas observou-se o aparecimento de picos cromatográficos quantificáveis, indicando a presença de compostos orgânicos na planta, porém, nenhum destes identificado como mentol. No meio de cultura com concentração de MS completo observou-se que o pH 4,0 obteve os melhores picos cromatográficos (Figura 1), porém, nenhum deles correspondeu a mentol, podendo ser estes, mentona, pulegona, cineol, mentofurano, linalol, ou tantos outros princípios encontrados na hortelã, que apenas poderão ser afirmados com uma análise de EM. É importante ressaltar que o valor de pH 4,0, em meio MS completo, foi o que apresentou um dos menores valores quanto ao peso fresco e altura de plantas, da mesma forma que em pH 6,5 de meio MS completo, observou-se o melhor desenvolvimento das plantas quanto ao peso e altura, e os menores picos cromatográficos (Figura 1), o que afirma a idéia de Tuomi et al. (1991 apud GARLET et al., 2007) que a concentração de metabólicos secundários tende a ser inversa às taxas de crescimento. No meio de cultura com redução de nutrientes, ½ MS, novamente o pH 4,0 foi o que apresentou melhores picos cromatográficos, conforme a Figura 1, o que indica que meios de cultura em que os valores de pH são mais ácidos, as substâncias são utilizadas para o metabolismo secundário e não no desenvolvimento da planta (metabolismo primário), por ser estes o custo de defesa da planta em condições adversas. Figura 1- Análises cromatográficas dos tratamentos com meio MS completo e pH 4,0; com meio MS completo e pH 6,5 e com meio ½ MS e pH 4,0, respectivamente. Conclusões - Apesar de um bom desenvolvimento das plantas cultivadas in vitro, nenhum dos tratamentos analisados apresentou mentol em teores quantificáveis, porém, outros compostos ativos presentes na hortelã foram detectados em análises de cromatografia gasosa, mas não foi possível identificá-los devido à ausência de uma espectrometria de massas. -Ao analisar os índices de desenvolvimento e os teores de princípios ativos, conclui- se o que alguns autores defendem que as taxas de metabólicos secundários (princípio ativo) tende a ser inversas as de crescimento da planta, já que este é seu custo de defesa. -Conforme se observou, nas análises de cromatografia gasosa, os maiores picos ocorreram nos tratamentos que apresentaram os menores índices de desenvolvimento, enquanto picos cromatográficos menores apresentaram maior desenvolvimento das plantas em relação ao peso fresco e altura. Bibliografia GARLET, T. M. B.; SANTOS, O.S.; MEDEIROS, S. L. P.; GARCIA, D. C.; MANFRON, P. A.; APEL, M. A. Produção de folhas, teor e qualidade de óleo essencial de hortelã- japonesa (Mentha arvensis L. forma piperascens Holmes) cultivadas em hidroponia. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. Botucatu, v.9, n.4, p. 72-79, 2007. Disponível em:. Acesso em: 16 out. 2008. TORRES, A.C.; CALDAS,L.S.; BUSO,J.A. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Volume II.Embrapa/Brasília.517p. 1999. A