Prof. Didier Salmon MSc Cristiane S. Lessa

Apresentação em tema: "Prof. Didier Salmon MSc Cristiane S. Lessa"— Transcrição da apresentação:

1 Prof. Didier Salmon MSc Cristiane S. Lessa
Ciclo de Krebs Prof. Didier Salmon MSc Cristiane S. Lessa . Bioquímica para Enfermagem Janeiro 2016 13/01/16

2 Ciclo de Krebs Também conhecido como ciclo do ácido cítrico ou ciclo dos ácidos tricarboxílicos; É o estágio final do metabolismo de carboidratos, aminoácidos e lipídeos; É executado na matriz mitocondrial de eucariontes e no citoplasma dos procariontes. Faz parte do metabolismo aeróbico; Foi descoberto por Hans Krebs

3 Vias Lineares Glicólise e Gliconeogênese GLICOSE PIRUVATO

4 Via Circular Ciclo do Ácido Cítrico ou Ciclo de Krebs
Representa o estágio final da oxidação de fontes de energia metabólica (carboidratos, ácidos graxos e aminoácidos) Rota central de recuperação de energia a partir de vários combustiveis metabólicos

5 Um pouco de história... Como resultados de experimentos Lavoisier postula que: “Na natureza nada se cria, nada se perde, tudo se transforma.” Equação de Lavoisier: Matéria orgânica + O2  CO2 + H2O + energia Otto Warburg busca entender a equação de Lavoisier em diferentes tecidos; Desenvolve um respirômetro para medir o consumo de O2 e a produção de CO2.

6 Respirômetro de Warburg
Era usado para medir a produção de CO2. Permitia determinar a estequiometria das reações. Células Produzem CO2 Formação de Bicarbonato ↓ Pressão no frasco ↑ Líquido na coluna Mede consumo de O2 pela diminuição da pressão e de CO2 por formação de bicarbonato Coloca o substrato Papel de filtro com KOH Tecido Meio de cultura Fluido com cor KOH + CO KHCO3 Pressão CO2

7 Destino do Piruvato na Presença de O2
A: Piruvato (C3) + 3O CO2 + 3H2O Szent – Györg (1930) testa ácidos C4 B: Piruvato (C3) + ácidos dicarboxílicos (C4) + nO nCO2 + nH2O 5 10 15 20 30 40 50 oxaloacetato succinato malato fumarato piruvato + tempo CO 2

8 Hans Krebs Krebs então testa outros ácidos dicarboxílicos. Em 1935 descobre que um deles, o α-cetoglutarato, com 5 carbonos, assim como nos experimentos de Szent-Györgyi, aceleravam a produção de CO2 e não eram consumidos na reação Em 1937 Krebs testa ácidos tricarboxílicos como citrato, isocitrato e aconitato, agora com 6 carbonos, e observa que a produção de CO2 também era estimulada e esses intermediários não eram consumidos.

9 Hans Krebs Segundo Krebs, outra contribuição significativa para suas descobertas veio dos estudos de Martius e Knoop, em 1937, que elucidaram a transformação oxidativa de citrato até α-cetoglutarato Em 1936, Carl Martius e Franz Knoop demonstraram que o citrato pode ser formado de modo não-enzimático a partir do oxaloacetato e do piruvato

10 Oxaloacetato (C4) + ???(C2) Citrato(C6)
Hans Krebs Krebs também observou que a formação de citrato (C6) ocorria rapidamente após a adição de oxaloacetato (C4) em diversos tecidos. Oxaloacetato (C4) + ???(C2) Citrato(C6) Composto vindo provavelmente da degradação da glicose Juntando as seguintes informações: 1- ácidos di- e tri- carboxílicos aceleravam a formação de CO2 em diversos tecidos mas não eram consumidos na reação. 2- algum composto de 2 carbonos vindo provavelmente da glicólise se combinava com oxaloacetato e formava um composto de 6 carbonos (citrato) que iniciava uma via de interconversão, Krebs conclui e postula um modelo que ele chamou de “Ciclo do Ácido Cítrico” ou dos “Ácidos Tricarboxílicos”.

11 Krebs então postula que:
“O piruvato, ou um derivado vindo da glicólise (acetato), se condensa com o oxaloacetato e forma citrato. Por uma sequência de reações que envolvem cis-aconitato, isocitrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato como intermediários, um ácido acético é oxidado e o oxaloacetato necessário para a reação inicial de condensação é regenerado. Isso explica a ação catalítica dos ácidos di e tricarboxílicos (de 4, 5 e 6 carbonos), bem como a capacidade que esses ácidos possuem de se oxidar nos tecidos que oxidam carboidratos.”

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13 Ciclo do Ácido Cítrico Mitocôndria Membranas interna e externa
Matriz Mitocondrial Matriz Todas as vias vistas anteriormente eram citosólicas, o ciclo de Krebs acontece dentro da mitocôndria, numa região conhecida como matriz mitocondrial. Membrana interna Membrana externa

14 Os experimentos de Fritz Lipmann
Naquela época já se sabia que a Coenzima A estava envolvida em reações de transferência de carbono e que ela era derivado do ácido pantotênico, uma vitamina pertencente ao complexo B (vit. B5). A descoberta da acetilCoA por Fritz em 1961 foi a peça final do quebra cabeça do ciclo do ácido citrico Ac. Pantotênico = Vit. B5

15 Os experimentos de Fritz Lipmann
Lipmann demonstra que o consumo de O2 é aumentado na presença de ácido pantotênico quando se fornece glicose-fosfato para leveduras Testou outras vitaminas que não surtiram o mesmo efeito.

16 Coenzima A Ubíqua nos tecidos
Síntese de citrato aumenta na presença de CoA Acetil-CoA é o composto de 2 carbonos

17 E como é formado Acetil-CoA a partir do piruvato?
Como é formada Acetil-CoA a partir do piruvato: complexo da piruvato desidrogenase This complex links the glycolysis metabolic pathway to the citric acid cycle

18 Pelo Complexo Piruvato Desidrogenase!!!
Complexo multienzimático associados de modo não covalente. Possui três tipos de enzimas em cópias múltiplas: E1, E2, E3 Grande o suficiente para ser visto em microscopia eletrônica E1= piruvato desidrogenase (amarelo) E2= di-hidrolipoil-transacetilase (verde) E3= di-hidrolipoil-desidrogenase (vermelho)

19 O Complexo Piruvato Desidrogenase
Reação de descarboxilação oxidativa Como é formada Acetil-CoA a partir do piruvato: complexo da piruvato desidrogenase This complex links the glycolysis metabolic pathway to the citric acid cycle Complexo multienzimático: grupos de enzimas associadas de modo não-covalente que catalisam duas ou mais reações seqüencias em uma rota metabólica Aumento a velocidade das reações, canalização dos intermediários minimizando as reações secundárias, controle coordenado das reações catalisadas

20 O Complexo Piruvato Desidrogenase
Descarboxilação Oxidativa 1- O piruvato reage com o TPP ligado à E1, sendo descarboxilado ao derivado hidroxietil; 2- Transferência de 2e- e do grupo acetil a partir do TPP para a forma oxidada do grupo lipoil-lisina do centro do complexo E2, formando o acetil-tio éster do grupo lipoil reduzido; 3- Transesterificação, o grupo SH da CoA substitui o SH da E2, produzindo Acetil CoA. 4- A E3 promove a transferência de 2 átomos de hidrogênio dos grupos lipoil reduzidos de E2 ao grupo prostético FAD de E3, restaurando a forma oxidada do grupo lipoil-lisina de E2. 5- O FADH2 reduzido de E3 transfere um ion hidreto ao NAD, formando NADH. O complexo enzimático está agora pronto para outro ciclo catalítico.

21 Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação TPP (tiamina) – Vitamina B1 FAD (riboflavina) – Vitamina B2 NAD (niacina) – Vitamina B3 CoA-SH (pantotenato) – Vitamina B5 Lipoato Thiamine pyrophosphate (TPP or ThPP), or thiamine diphosphate (ThDP), is a thiamine (vitamin B1) derivative which is produced by the enzyme thiamine pyrophosphatase. Thiamine pyrophosphate is a cofactor that is present in all living systems, in which it catalyzes several biochemical reactions. It was first discovered as an essential nutrient (vitamin) in humans through its link with the peripheral nervous system disease Beriberi, which results from a deficiency of thiamine in the diet.[1] TPP works as a coenzyme in many enzymatic reactions, such as: Pyruvate dehydrogenase complex[2] Pyruvate decarboxylase in ethanol fermentation Alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex Branched-chain amino acid dehydrogenase complex 2-hydroxyphytanoyl-CoA lyase Transketolase Tiamina (Vitamina B1)

22 Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação TPP (tiamina) FAD (riboflavina) NAD (niacina) CoA-SH (pantotenato) Lipoato FAD: mononucleotídeo de flavina (FMN) ligado a um nucleotídeo de adenina. Assim como o NAD, funciona como um aceptor/doador de elétrons importantes, entretanto, podem aceitar um ou dois elétrons. Participam de uma diversidade maior de reações. Riboflavina (Vitamina B2)

23 Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação TPP (tiamina) FAD (riboflavina) NAD (niacina) CoA-SH (pantotenato) Lipoato Estrutura: dois nucleotídeos ligados, um tem adenina como base, o outro tem nicotinamida Os elétrons podem entrar em duas posições na nicotinamida: na frente (A) ou atrás (B). Aceitam dois elétrons NADH detectado em 340nm, NAD não. Detecção de balanço redox celular Niacina (Vitamina B3)

24 Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação TPP (tiamina) FAD (riboflavina) NAD (niacina) CoA-SH (pantotenato) Lipoato Pantotenato, vitamina B5 Vitamina B5

25 Cinco coenzimas, Quatro vitaminas
Cinco coenzimas (Grupos prostéticos) participam da reação TPP (tiamina) FAD (riboflavina) NAD (niacina) CoA-SH (pantotenato) Lipoato Ácido Lipoico, derivado do ácido octanoico. Tem dois grupos tiol ligados por uma ponte de dissulfeto. Devido a sua capacidade de parcicipar de reações de oxidação e redução, o lipoato atua como transportador de acilas (R-CO-). Lipoato Atua como transportador de acilas.

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27 Beriberi – Deficiência de B1
A tiamina está envolvida em várias funções após fosforilada no organismo: Metabolismo de carboidratos; Metabolismo de lipídeos (mielina); Metabolismo de aminoácidos; Produção de neurotransmissores; Sua falta provoca doenças, como o beribéri, caracterizada por perda da função neural. Doença que estava no ED1 Thiamine has a half-life of 18 days and is quickly exhausted, particularly when metabolic demands exceed intake. Thiamine is involved in a variety of glucose metabolism-related and neurological functions. After modification in the body to a diphosphate form, thiamine is involved in a vast array of functions: Carbohydrate metabolism[2] Production of the neurotransmitters glutamic acid and GABA, through the TCA cycle[2] Lipid metabolism, necessary for myelin production[2] Amino acid metabolism[2] Neuromodulation.[3] Neurons are very sensitive to ionic and metabolic changes produced in their immediate environment, which initially affect metabolism, electrical activity and performance, but then can lead to cell death.[citation needed] Principais causas: Dieta pobre em B1; Abuso de álcool (dificulta absorção da B1); Baixa absorção da vitamina B1 pelo intestino (como por infecção de Penicillium citreonigrum); Diarreias e/ou vômitos por longos períodos; Genética (rara)

28 Ciclo de Reações da PD Hidroxietil-TPP
Piruvato Desidrogenase (E1) Diidrolipoil Transacetilase (E2) Diidrolipoil Desidrogenase (E3)

29 Lipoamido = ácido lipóico ligado a um resíduo lisina
Piruvato Desidrogenase (E1) Diidrolipoil Transacetilase (E2) Diidrolipoil Desidrogenase (E3)

30 Hidroxietil-TPP Acetil- diidrolipoamido Transesterificação e produção da AcetilCoA Oxidação da hidroxietil a acetila na redução do dissulfeto do lipoamida Piruvato Desidrogenase (E1) Diidrolipoil Transacetilase (E2) Diidrolipoil Desidrogenase (E3)

31 Hidroxietil-TPP diiidrolipoamido Piruvato Desidrogenase (E1) Diidrolipoil Transacetilase (E2) Diidrolipoil Desidrogenase (E3)

32 Hidroxietil-TPP Regeneração do lipoamido Piruvato Desidrogenase (E1) Diidrolipoil Transacetilase (E2) Diidrolipoil Desidrogenase (E3)

33 Arsênico MAS... O complexo piruvato desidrogenase pode ser inibido pela reação do grupo lipoamido com compostos que contêm arsênico

34 Resumindo as reações do PDH
E1= piruvato desidrogenase Piruvato + TPP Hidroxietil-TPP + CO2 E2= dihidrolipoil transacetilase Hidroxietil-TPP + lipoil-lisina oxidada TPP + Acetil tioester da lipoil-lisina reduzida E2= dihidrolipoil transacetilase Acetil tioester da lipoil-lisina reduzida + CoA Acetil-CoA + lipoil lisina reduzida Resumo das reações catalisadas pelo complexo da Piruvato Desidrogenase E3= dihidrolipoil desidrogenase: restauração do complexo PDH ao seu estado inicial (regeneração da lipoamida oxidada e produção de FADH2 e redução do FADH2 pelo NAD produzindo NADH )

35 Regulação do Complexo Piruvato Desidrogenase
Inibida quando [ATP/ADP], [NADH/NAD+] e [acetilCoA/CoA] Balanço energético positivo Inibida por ácido graxos de cadeia longa (modificação alostérica) Por modificação covalente de E1 (mamíferos): piruvato desidrogenase cinase fosforila E1 inativa o PDC (ATP é um ativador alostérico desta cinase) piruvato desidrogenase fosfatase: reativa o PDC

36 A insulina reverte essa inativação ativando a PD fosfatase promovendo
a síntese de acetil-CoA

37 As Reações do Ciclo de Krebs
Matriz Mitocondrial

38 1) Citrato Sintase Sintase: reação de condensação sem nucleosídeo trifosfato (ATP, GTP...) ou outra origem de energia O carbono do metil do grupo acetil é unido ao grupo carbonil do oxaloacetato

39 1) Citrato Sintase Exemplo de reação cinética sequencial ordenada Esse encaixe induzido da enzima, primeiro ao substrato e posteriormente ao intermediário da reação, dimunui a probabilidade de que a clivagem da ligação tio éster da acetil-coa seja prematura e improdutiva. Oxaloacetato (em amarelo) é o primeiro substrato a se ligar, e promove uma mudança conformacional, criando um sítio de ligação para o segundo substrato, o Acetil-CoA (em vermelho um análogo da Acetil-CoA) = reação cinética seqüencial ordenada

40 1) Citrato Sintase Importância da ligação tioéster
Devido as energias de ativação padrão relativamente altas, os tio ésteres têm um alto potencial para transferência do grupo acil e podem doar esse grupo a diversas moléculas aceptoras.

41 2) Aconitase Isomerização de citrato a isocitrato via cis-aconitato
Aconitase contêm um grupo ferro-enxofre 4Fe-4S Isomerização estereo-específica

42 3) Isocitrato Desidrogenase
Ocorre a primeira descarboxilação oxidativa com liberação com conservação de energia na forma de NADH O CO2 eliminado vem do OAA não do acetil-CoA

43 4) a-Cetoglutarato Desidrogenase
Perda do grupo carboxila na forma de CO2 e Energia de oxidação conservada na ligação tioéster

44 5) Succinil-CoA Sintetase
Energia livre de hidrólise da ligação tioéster do succinil-CoA forte e negativa (-36 kJ/mol) Sintetase: reação de condensação com uso de nucleosídeos trifosfato Essa reação tem etapas intermediárias...

45 5) Succinil-CoA Sintetase
Etapas intermediárias... CoA da succinil-CoA ligada a enzima é substituída por um grupo fosfato, formando um acil-fosfato de alta energia. O succinil-fosfato doa o grupo fosfato para um resíduo de His da enzima, originando um fosfo-histidil-enzima de alta energia. O grupo fosfato é transferido do resíduo de His ao fosfato terminal do GDP ou ADP, formando ATP ou GTP Fosforilação a nível do substrato, como na glicólise.

46 6) Succinato Desidrogenase
Catalisa a desidrogenação estereoespecífica do succinato em fumarato Única enzima do ciclo que não se encontra solúvel na matriz Malonato, análogo ao succinato, normalmente ausente nas células, é um forte inibidor competitivo da succinato-desidrogenase e sua adição à mitocôndria bloqueia a atividade do ciclo do ácido cítrico. Malonato = inibidor competitivo

47 Os elétrons do succinato passam pelo FAD e pelos centros de ferro-enxofre antes de entrarem na cadeia transportadora de elétrons da membrana mitocondrial interna (da membrana plasmática em bactérias). O fluxo dos elétrons do succinato ao longo desses transportadores até o aceptor de elétrons final, o2, é acoplado à síntese de aproximadamente 1,5 molécula de ATP por par de elétron.

48 7) Fumarase Hidratação do fumarato a malato

49 8) Malato Desidrogenase
Regeneração do Oxaloacetato pela oxidação do malato Regeneração do Oxaloacetato

50 Saldo Final 3 NADH 1 FADH2 1 GTP ou ATP
GTP possui o mesmo nível energético que o ATP A energia liberada pelas oxidações foi conservada pela redução de 3NAD e um FAD e pela produção de ATP ou GTP e ao final do ciclo o oxaloacetato foi regenerado

51 Componentes do TCA são importantes intermediários anabólicos
O ciclo de Krebs é uma via anfibótica, serve para processos catabólicos e anabólicos; Intermediários da via são precursores de vias de biossíntese: - Oxaloacetato convertido em glicose na gliconeogênese; - Succinil-CoA é intermediário central para a síntese do anel porfirínico dos grupos heme e transportadores de elétrons; - O citrato produzido por alguns organismos é usado na industrias para variados propósitos; Esses intermediários são repostos por reações anapleróticas. Sob circunstâncias normais, há um equilíbrio dinâmico nas reações que desviam os intermediários a outras vias e os repõem, de modo que as concentrações dos intermediários do ciclo permaneçam constantes.

52 Componentes do TCA são importantes intermediários anabólicos
Reações anapleróticas repõem os intermediários

53 O catabolismo de proteínas gera diversos intermediários do TCA

54 Regulação do Ciclo de Krebs
Regulação em dois níveis principais: Conversão de piruvato a Acetil-CoA (piruvato desidrogenase) A entrada de acetil-CoA no ciclo (citrato-sintase) Regulada também: Na reação da Isocitrato-desidrogenase; Na reação da alfa-cetoglutarato-desidrogenase Cálcio ativa piruvato desidrogenase fosfatase = ativa a PD; ativa a isocitrato e alfa cetoglutarato desidrogenase

55 Regulação do Ciclo de Krebs
No músculo cardíaco o fluxo de metabólitos no TCA é proporcional a taxa de consumo de oxigênio : Piruvato carboxilase 3 níveis de regulação: Disponibilidade de Substrato Inibição por acumulo de Produto -Inibição competitiva retroativa pelos intermediários Cálcio ativa piruvato desidrogenase fosfatase = ativa a PD; ativa a isocitrato e alfa cetoglutarato desidrogenase As velocidades da glicólise e do ciclo de Krebs estão integradas de modo que a quantidade de glicose metabolizada a piruvato seja suficiente ara suprir o ciclo com seu combustível. A velocidade da glicólise é vinculada a velocidade do ciclo não apenas por meio de ATP e NADH, os quais são comuns a ambos os estágios de oxidação da glicose, via glicolítica e respiração, mas também é regulada pela concentração de citrato. O citrato é inibidor da fosfofrutoquinase-1 Velocidades da glicólise e do CK são reguladas de maneira integrada (NADH, ATP, Citrato) Diabetes e formação dos corpos cetónicos...