Teste de Activação de Basófilos por Citometria de Fluxo

Apresentação em tema: "Teste de Activação de Basófilos por Citometria de Fluxo"— Transcrição da apresentação:

1 Teste de Activação de Basófilos por Citometria de Fluxo
Aplicação presentes e futuras na Alergologia Teste de Activação de Basófilos por Citometria de Fluxo

2 Introdução O diagnostico das reacções alérgicas na prática medicinal resulta tanto do historial clínico como de testes e demonstrações a imunoglobulinas E específicas do soro e dos tecidos do indivíduo. BAT

3 Princípios Basófilos são granulócitos que representam menos de 1% dos leucócitos. A activação do basófilo pode seguir dois caminhos principais: a degranulação anafilática (AND) e a degranulação fragmentada (PMD), caracterizada por alterações morfológicas e secreção do conteúdo do grânulo sem exocitose. Marcadores principais: FcεRI, CD36,CD203c, P38 MAPK

4 Colheita e Preservação
Uso até 3H após a recolha, tubo sem endotoxinas, anticoagulante EDTA ou heparina e temperatura ambiente Uso ate 24H após a recolha, anticoagulante EDTA e temperatura 4ºC

5 Sangue Total ou Basófilos Isolados
É simples isolar os leucócitos do sangue total, utilizando técnicas de centrifugação e de gradientes de densidade.

6 Condições de Estimulação
Após a estimulação, os basófilos reagem imediatamente, se as condições se encontrarem ideais. O pré-aquecimento de sangue, bem como o contacto com os reagentes por 15 min a 37ºC melhora significativamente a latência e magnitude de anti-IgE mediada por CD63.

7 Marcação com IL-3 Alguns autores têm mostrado que uma curta pré-incubação com IL-3 pode aumentar a sensibilidade dos ensaios baseados em CD63, mas esta medida não parece ser crucial para os potentes alérgenos proteicos e de estimulação com soro de pacientes com urticária auto-imune.

8 Estimulação do Controlo Positivo e Negativo
Para que haja uma interpretação correcta da BAT é necessário ter em conta a influência dos estímulos positivo e negativo. Tradicionalmente, o controlo positivo é um anticorpo policlonal ou monoclonal anti-IgE. Na ausência de estimulação controle positivo, torna-se impossível interpretar correctamente os resultados negativos das reacções alérgicas.

9 Estimulação do Alergénio
A análise de fluxo assistida e quantificação in vitro de basófilos activados geralmente depende da utilização de extractos de alérgenos naturais.

10 Experiência de dosagem
As respostas dos basófilos podem ser extremamente heterogéneas entre diferentes indivíduos. No entanto, a fosforilação de alérgenos específicos de p38 MAPK, de CD63 e CD203c geralmente não é restrita a um único estímulo, mas implica diferentes concentrações de estimulação que se estendem por várias escalas.

11 Marcadores de Identificação
Na maioria dos estudos correntes foi aplicado um anticorpo anti-IgE na amostra de sangue periférico com o objectivo de identificar os basófilos. Como outras células do sangue podem ser apresentar este anticorpo, para o estudo de citometria de fluxo a amostra deve contem CD203c, uma vez que a expressão desta é exclusiva da superfície dos basófilos.

12 Marcadores de Activação
No presente, os marcadores de activação mais utilizados são CD63 e CD203c.

13 Análise de Basófilos do Paciente
Actualmente, a análise de fluxo assistida e quantificação de basófilos activados in vitro mostrou-se sensível e específica para o diagnóstico de várias alergias mediadas por IgE, incluindo os clássicos alérgenos inalantes (ácaros, epitélio do gato, e pólen), alergia ao veneno de hymenoptera, alergia natural ao látex de borracha, alergias primárias e secundárias a alimentos e medicamentos.

14 Análise de Basófilos de dadores atópicos
A análise de fluxo assistida e quantificação de basófilos in vitro activados também pode ser aplicada em células obtidas de indivíduos atópicos

15 Aplicações da Pesquisa
A citometria de fluxo pode fornecer resultados referentes à dose de respostas e cinética de fosforilação de p38 MAPK qualitativamente similares aos dados obtidos com a técnica Wesern-blot. A citometria de fluxo oferece diferentes oportunidades que a tornam mais adequado para aplicação clínica.

16 Conclusão, perspectivas, pontos de vista especulativos
JOANA VINES, CIÈNCIA VIVA, FACULDADE DE CIÈNCIAS MÉDICAS DE LISBOA