Preparo das amostras para espectrometria de massa

Apresentação em tema: "Preparo das amostras para espectrometria de massa"— Transcrição da apresentação:

1 Preparo das amostras para espectrometria de massa
Fabiane Maria Lima Sousa Mestranda PPGZ-UFC Orient.: Prof.: Arlindo Moura

2 A digestão é necessária para que todas as partes da proteína fiquem uniformemente expostas à dissociação e ionização, e para aumentar a eficiência desses processos. As bandas/spots protéicos correspondentes à proteína de interesse serão: Excisadas Descoradas Submetidas à digestão enzimática

3 Imagem gerada pelo PDQuest: Master gel

4 Proteases normalmente utilizadas: Quimotripsina Pepsina
Carboxipeptidases Aminopeptidases Tripsina ou uma combinação delas Capacidade Previsibilidade Disponibilidade

5 Cuidados no procedimento
Manter o gel umedecido com água destilada para evitar o ressecamento. Deve-se usar reagentes de boa qualidade e procedência conhecida. Durante os procedimentos de corte e digestão, é importante o uso de luvas, jaleco de mangas compridas, e, se possível, touca e máscara, para evitar contaminações, a principal é a queratina humana.

6 Etapas do procedimento
Excisão ou corte dos spots Spot no gel, é cortado no centro e dividido em pedaços menores. Existem os métodos manuais (tesoura, bisturi ou gilete), e existe um método computadorizado (spot picker).

7 Excisão manual com bisturi

8 Método computadorizado (Spot picker)

9 Lavagem do gel Solução de acetonitrila/bicarbonato de amônio
Desidratado o gel com acetonitrila Remover a acetonitrila e secar completamente os géis no Speed Vac.

10 Digestão com tripsina Solução de tripsina diluída será distribuída de forma a cobrir os pedaços de gel. Extração dos peptídeos (por meio de lavagens)com ácido fórmico 5% ou TFA 5%/ acetonitrila 50%. Concentrar as amostras .

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12 Obrigada