Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas

Apresentação em tema: "Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas"— Transcrição da apresentação:

1 Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas
3/25/2017 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas Prof. Fabricio Rochedo Conceição 27 de março de 2012 1

2 Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?
Estudos bioquímicos Determinação da estrutura 3D Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico... Alternativa para as seguintes limitações: Quantidade Dificuldade de purificação a partir do tecido original Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

3 Pneumonia Micoplásmica Suína
Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

4 Como prevenir? Botulismo Toxóide Toxina botulínica
Clostridium botulinum C e D Botulismo Toxina botulínica Como prevenir? Toxóide

5 Sistemas de expressão de proteínas heterólogas
***Algas, animais e plantas

6 2. Expression vectors 3. Hosts

7 Relação volume meio/capacidade do frasco
0,2 (20%) Inóculo – 5 a 10%

8 Bactérias e leveduras Produção industrial Microalgas

9 Algumas empresas que comercializam insumos para a expressão de proteínas heterólogas

10 BACTÉRIAS Escherichia coli Bacillus subtilis Cultivo: - 28 a 37 C
Aerobiose pH neutro Fonte de C e N, microelementos (sais)

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13 APLICAÇÕES - Minimizar a proteólise Maximizar a expressão Minimizar “vazamento” de expressão (expressão de proteínas tóxicas) Facilitar o folding Solubilidade

14 Expressão heteróloga em E. coli
Vantagens Desvantagens Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveis Atividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

15 *** Alternativas

16 Expressão heteróloga em B. subtilis
Vantagens Desvantagens Não patogênico (sem LPS); GRAS Proteases extracelulares Codon usage adequado Plasmídeos instáveis Possibilidade de secreção da proteína Expressão geralmente menor que E. coli Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas Alta produção de proteínas heterólogas *** Alternativas

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18 Leveduras Eucariotos unicelulares – “organelas” Multiplicação rápida
Manipulação simplificada Altas densidades celulares Não Patogênicas (GRAS) Fisiologia e genética bem conhecidas Realizam modificações pós-traducionais

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20 Principais espécies utilizadas
Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica

21 Desvantagens Saccharomyces cerevisiae
Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose Alteração da antigenicidade da proteína Alteração da estrutura 3D Produção de etanol – tóxico Falha na secreção de proteínas Alternativa: outras espécies de leveduras

22 Pichia pastoris Metilotrófica – metanol como fonte única de carbono
Glicosilação mais estável e semelhante a de mamíferos Fermentação pobre – não produz etanol e atinge altas densidades celulares 28 a 30 C, aerobiose, pH 5,0 - 6,0 Fonte de C (glicerol, metanol...) Fonte de N (sulfato de amônio)

23 Pichia pastoris Desvantagens Proteólise de proteínas secretadas
Poucos vetores disponíveis (Invitrogen) Necessita o uso de fermentadores para atingir alta densidade celular – no entanto não realiza fermentação. Precisa de oxigênio!

24 Metabolismo do Metanol
Álcool Oxidase Dois genes: AOX1 e AOX2 AOX1 é mais expresso e altamente induzido na presença de metanol Enzima tem baixa afinidade por metanol, formando formaldeído. Compensa produzindo grande quantidade de AOX (~30% do total de prot)

25 Fenótipos Mut = Metanol Utilization
Mut+ - crescimento rápido em metanol MutS – crescimento lento em metanol

26 Cepas

27 CLONAGEM - INTEGRAÇÃO

28 Proteínas expressas em Pichia

29 MICROALGAS Eucariotos unicelulares que realizam fotossíntese
Elaboração de alimentos e obtenção de compostos naturais de valor agregado “Best of both worlds” Microrganismos: rápido crescimento e facilidade de cultivo Plantas: capacidade de realizar modificações pós-transcripcionais/traducionais Rápida produção e scale up Meio de cultivo muito barato: sais, CO2 e luz solar Não Patogênicas (GRAS) Baixo custo de produção de algumas proteínas recombinantes Chlamydomonas, Chlorella, Volvox, Haematococcus e Dunaliella Baixa expressão de proteínas heterólogas

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31 Chlamydomonas reinhardtii

32 Cultivo: No geral 18 a 22 C Agitação Luz natural ou fluorescente pH 8,2 – 8,7 Microelementos (P, Zn, B...) Salinidade 20 a 24 g.L-1

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