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Espectrofotometria Graduação em Biotecnologia
Disciplina de Técnicas Instrumentais Prof. Fabricio Rochedo Conceição Espectrofotometria 11 de maio de 2012
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Espectrofotometria visível e ultravioleta
Método analítico baseado em medidas de absorção de radiação eletromagnética Permite identificar e quantificar compostos orgânicos e inorgânicos Região ultravioleta – 200 a 400 nm Região visível – 400 a 800 nm
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Aplicações Esta técnica é muito usada em laboratórios de controle de qualidade (indústrias), pesquisa e de análises clínicas e toxicológicas Em biotecnologia: - Proteômica - Genômica - Transgenia - Expressão de proteínas recombinantes... *** Análise de proteínas, DNA e RNA
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Absorção de Radiação Vários fenômenos podem ocorrer com a radiação luminosa, como: reflexão, refração, espalhamento ou absorção
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Absorção de Radiação Os comprimentos de onda que uma certa substância absorverá são característicos da sua estrutura, diferindo de substância para substância. Exemplos: DNA e RNA = 260 nm Proteínas = 280 nm Células bacterianas = 600 nm Benzeno = 255 nm ...
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Lei de Lambert-Beer Através dessa lei, intensidades da radiação incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentrações do material presente na solução Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não são considerados nessa lei. A radiação incidente deve ser monocromática
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Lei de Lambert-Beer A = - log10 T T = I1 / I0
I0 = intensidade da luz incidente I1 = é a intensidade da luz uma vez tendo atravessado o meio l = é a distância que a luz atravessa A = - log10 T T = I1 / I0
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Absorbância Transmitância
É a capacidade do material em absorver radiações de comprimento de onda específico. 0 a 2 Transmitância É a intensidade de luz remanescente após passar por uma amostra de matéria. 0 a 100%
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ENFIM, a lei de Lambert-Beer permite determinar a concentração de uma substância em função da absorção de luz
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Espectrofotômetro É um instrumento que serve para medir a intensidade da luz em função de um comprimento de onda específico.
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Diagrama de um espectrofotômetro
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Fontes luminosas mais comuns
Luz UV Lâmpada de gás hidrogênio ou deutério Mercúrio Luz Visível Tungstênio
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Cubetas Espectrofotometria de Luz Visível
Cubeta de Vidro ou Plástico Espectrofotometria de Luz Ultravioleta Cubeta de Quartzo
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Dicas Localização do espectrofotômetro
- Bancada estável e exclusiva (se possível) - Longe de fontes eletromagnéticas (rádio, microondas...) Ligar 30 mim antes do uso Cubetas (tipo e manuseio) Calibração
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Obrigado!
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