Cinética enzimática: Inibição enzimática Prof. Adriane M. F. Milagres

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1 Cinética enzimática: Inibição enzimática Prof. Adriane M. F. Milagres
Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática: Inibição enzimática Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP

2 Cinética enzimática Sumário: Inibição reversível Modelos de inibição
Modificação química Inibição irreversível

3 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS
Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática. INIBIDORES REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS Competitivos Não Competitivos Incompetitivos

4 INIBIÇÃO COMPETITIVA: substrato e inibidor competem para o mesmo sítio
Km kcat K4[E] [I] = K5[EI [K5] = [E] [I] [K4] [EI] 1) V = K3 [ES] 2) [ET] = [E] +[ES] +[EI] V = K3 [ES] [ET] [E] +[ES] +[EI] [E][S] V = Vmax Km [E] + [E][S] + [E][I] Km Ki V = Vmax [S]______ Km (1 +[I]) + [S] Ki

5 INIBIÇÃO COMPETITIVA V = Vmax [S]______ Km (1 +[I]) + [S] Ki
V Vmax [S] Vm 1- sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

6 INIBIÇÃO INCOMPETITIVA:
substrato e inibidor ligam-se em sítios diferentes

7 INIBIÇÃO INCOMPETITIVA:

8 INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA
1- sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

9 INIBIÇÃO MISTA α

10 Diagrama Lineweaver-Burk para inibição mista

11 EQUAÇÃO GERAL DE INIBIÇÃO
Km K3 α αKm βK3 α = ∞ e β = 0 - Inibição competitiva pura 1 < α <∞ e β = 1 - Inibição competitiva parcial α = 1 e β = 0 - Inibição não competitiva pura α = 1 e 0< β <1 - Inibição não competitiva parcial 1 < α <∞ e β = 0 - Inibição tipo misto 1 < α <∞ e 0< β <1 – Inibição do tipo misto com β# 0

12 Para inibições com diagnóstico hiperbólico
1_____ interc. 1_____ interc. 1_____ inclin. 1_____ inclin. βVm 1-β βVm Ks(α- β) 1__ [i] -β αKi

13 INIBIÇÃO PELO PRODUTO

14 INIBIÇÃO PELO SUBSTRATO
Se K4 = 0 Se 0 < K4 < K2

15 Exemplo 1: Síntese de Dopamina

16 Exemplo 2: Fosfofrutoquinase Frutose 6P Frutose 1,6 BiP ATP ADP

17 MODIFICAÇÃO QUÍMICA V = K2 [M][E] V = KOBS [E] KOBS = K2 [M] K2 = KOBS
Moléculas específicas podem interagir com a enzima inibindo-a Inibidores irreversíveis K2 E + M F em que: E – enzima M – modificador F – enzima modificada inativa K2 - constante de segunda ordem V = K2 [M][E] V = KOBS [E] Log Enzima Remanescente (%) KOBS = K2 [M] K2 = KOBS M Kobs t

18 F e [M] >>> [E] E + nM
Segundo caso: n é o numero de moléculas para inativar a enzima k2 F e [M] >>> [E] E + nM Kobs = k2 Mn Log Kobs = log K2 + nlog M n Log Kobs Log M

19 Inibidores irreversíveis:
Compostos orgânicos clorados ou fosforados reagem com o resíduo S1 de serino-enzimas, formando um complexo irreversível. Uma das enzimas altamente sensível a esses compostos é a acetilcolinesterase, responsável pela metabolização do neurotransmissor acetilcolina em neurônios centrais e periféricos. Este é o mecanismos de ação dos inseticidas organofosforados, como o malathion e o parathion. Inseticidas organofosforados dose letal: 3-13 mg/Kg, oral meia vida – 23 anos “gás dos nervos” (dose letal 0,01 mg/kg, oral),

20 PMSF phenylmethane sulphonyl fluoride
H3C SO2F No laboratório, serino-enzimas podem ser identificadas por serem eficientemente inibidas por compostos organofosforados menos tóxicos como o diisopropilfluorofosfato (DFP) ou o fluoreto de fenilmetilenosulfonila (PMSF). PMSF phenylmethane sulphonyl fluoride

21 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade de S e da própria E ?
A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas vezes atuam em conjunto na mesma enzima. Entre estes mecanismos, destacam-se: Inibidores: irreversíveis: não protéicos e protéicos reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo Alosteria: ativadores e inibidores cooperatividade Modulação covalente Fosforilação e defosforilação Ativação de zimogênios Agora vamos falar de:

22 Fosforilação - Defosforilação
Ao contrário da alosteria, em que os efetores ligam-se à enzima apenas por ligações fracas, na modulação covalente a enzima é modificada covalentemente por duas outras enzimas: uma quinase fosforila a enzima às custas de ATP, e uma fosfatase remove o grupo fosfato da enzima fosforilada. A modulação covalente é energéticamente cara, pois necessita duas outras proteínas e ATP para regular a atividade de uma enzima. Ao contrário, na alosteria a enzima é controlada pelas concentrações relativas de seus efetores e a afinidade da enzima por estes. enzima fosfato substrato Fosforilação - Defosforilação fosfatase inativa ativa quinase

23 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade de S e da própria E ?
A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas vezes atuam em conjunto na mesma enzima. Entre estes mecanismos, destacam-se: Inibidores: irreversíveis: não protéicos e protéicos reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo Alosteria: ativadores e inibidores cooperatividade Modulação covalente Fosforilação e defosforilação Ativação de zimogênios Agora vamos falar de:

24 Ativação de zimogênios é um caso específico de modulação covalente exclusivo de alguns tipos de enzimas proteolíticas. zimogênios: as proteases são sintetizadas numa forma inativa por estar em uma conformação desfavorável, com bloqueio ou desalinhamento dos resíduos do sítio catalítico. conformação desfavorável resulta de porções adicionais da cadeia poli-peptídica, que devem ser retirados para que a proteína assuma a forma ativa. podem acontecer duas situações, combinadas ou não: - zimogênio tem uma extensão N-terminal (pro-segmento) que precisa ser retirada. Pro-segmentos podem ter de 2 a 150 resíduos a.a. - zimogênio tem cadeia polipeptídica única, que precisa ser clivada (proteólise limitada) para formar duas ou mais subunidades. conversão do zimogênio à protease ativa pode resultar da ação proteolítica de outra protease, ou de alteração do pH ou temperatura do meio, ou ainda, da adsorção do zimogênio à uma superfície negativa. Esses eventos determinam mudança conformacional e/ou auto-hidrólise pela própria protease. ativação é irreversível, e porisso, energeticamente cara para o organismo.