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UBAIII Biologia Molecular
1º Ano 2012/2013
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Sumário: D. Técnicas de Biologia Molecular em Ciências da Saúde
Capítulo XIV. Técnicas básicas para o estudo de ácidos nucleicos. Isolamento e purificação de ácidos nucleicos Separação de ácidos nucleicos Visualização Tecnologia de DNA recombinante Capítulo XV. Biotecnologia Aplicada às Ciências da Saúde Microarrays princípios da técnica O que são microarrays? Vários tipos de sondas (DNA, cDNA, RNA, proteínas) Hibridização Leitura Aplicações dos microarrays em medicina: Expressão diferencial de genes Biomarcadores Marcadores de alvos clinicos, funções biológicas semelhantes, ligação entre genes Detecção de agentes patogénicos MJC-T14 17Jan/2013
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Purificação dos ácidos nucleicos
Homogeneização das células Lise nuclear com solução tamponada de NaCl com SDS. Precipitação proteica com fenol/clorofórmio Centrifugação Adição de etanol precipitação dos ácidos nucleicos Separação das proteínas e RNA MJC-T14 17Jan/2013
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Obtido o DNA em filamentos brancos
É novamente dissolvido em solução aquosa Tratado com RNAse Pode ser também obtido RNA se o tratamento for feito com DNAse RNAse ou DNAse removidas com protease Lavagem com fenol (para remover .....) Precipitação com etanol. MJC-T14 17Jan/2013
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Mais recentemente.... Colunas para isolamento de DNA
Membranas e matrizes que ligam DNA especificamente Lisado de células + matriz lavado e centrifugado Eluição da matriz. MJC-T14 17Jan/2013
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Separação do DNA Tamanho Composição de bases Electroforese
Topologia Sequência de nucleótidos Electroforese Ultracentrifugação MJC-T14 17Jan/2013
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Electroforese http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/ MJC-T14
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Ultracentrifugação – Velocidade de sedimentação
Unidades S influência da massa. MJC-T14 17Jan/2013
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Ultracentrifugação – Centrifugação equilibrada
Separa também moléculas com radioisótopos. MJC-T14 17Jan/2013
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Hibridização de ácidos nucleicos
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Hibridização de ácidos nucleicos
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Tecnologia do DNA recombinante – enzimas de restrição
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Formação do DNA recombinante
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Clonagem do DNA em bactérias
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Clonagem do DNA em bactérias
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Clonagem do DNA em bactérias
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Clonagem do DNA em bactérias
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Clonagem do DNA em bactérias-screening
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Clonagem do DNA em bactérias-screening
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Separação dos Plasmideos por centrifugação
Corte com as enzimas de restrição iniciais MJC-T14 17Jan/2013
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Clonagem do DNA em vírus
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Clonagem do DNA em vírus
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Clonagem do DNA em vírus
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O que significa Microarray?
High throughput MJC-T14 17Jan/2013
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O que é posto nas lâminas?
Sondas (?) Moléculas com capacidade de se ligar a outras hibridizar DNA cu RNA Proteínas Qual a origem deste material? Bibliotecas de DNA Genómicas cDNA DNA Com que hibridizam? MJC-T14 17Jan/2013
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Escolha das sondas a utilizar
Comprimento bases Especificidade Impressão da lâmina Orientação do fragmento Hibridização pretendida As sondas hibridizam com a amostra que é marcada com fluorescência. Assim um sinal fluorescente no resultado o que significa? MJC-T14 17Jan/2013
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Condições de hibridização
Quantidade e qualidade da amostra Replicação com [amostra] Solução de hibridização e lavagem Normalmente é definida pelo fabricante do chip Tempo de incubação Gerido em função de estudos piloto e também definido pelo fabricante Temperatura de incubação Depende por vezes da sequência (conteudo GC) Porquê? MJC-T14 17Jan/2013
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Leitura do chip Depende de ter sido utilizado 1 ou 2 corantes diferentes MJC-T14 17Jan/2013
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Expressão diferencial de genes
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Expressão diferencial de genes
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Expressão diferencial de genes
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Recursos utilizados Capítulo 18 Karp secções e secção Capítulo 12 Karp secção 12.4 html (Microarray de DNA de leveduras). MJC-T14 17Jan/2013
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