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Formas de calibração 1º - Padrões externos É a forma mais utilizada de calibração. São utilizadas soluções contendo concentrações conhecidas do analito.

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1 Formas de calibração 1º - Padrões externos É a forma mais utilizada de calibração. São utilizadas soluções contendo concentrações conhecidas do analito. Os padrões são considerados “externos” pois são preparados e analisados separadamente das amostras. Normalmente são utilizados soluções com concentrações crescentes do padrão do analito e correlacionando-se a resposta instrumental com a concentração, se obtêm uma curva de calibração.

2 Formas de calibração A curva de calibração pode ser linear (correlação entre resposta instrumental e concentração apresenta função linear) ou polinomial (correlação entre resposta instrumental e concentração apresenta função polinomial). Curva de calibração Curva de calibração linear não linear

3 Exemplo Formas de calibração
A curva linear é mais adequada pois apresenta a mesma sensibilidade para toda a faixa de calibração. Nas curvas não lineares, a sensibilidade é função da concentração. Exemplo Um método espectrofotometrico para a determinação quantitativa de Pb2+ em sangue forneceu uma curva de calibração linear com a seguinte equação: Y = X Sabendo que a curva foi construída na faixa de ug/L, qual a concentração de Pb em uma amostra que apresentou uma absorbância de 0.397?

4 Formas de calibração Limitação da curva de calibração normal
A relação entre a resposta instrumental (Spadrão e Cpadrão) é determinada quando o analito está presente na matriz da solução padrão que pode ser diferente da matriz da amostra. Quando se utiliza a curva de calibração normal, assumimos que qualquer diferença entre a matriz dos padrões e a matriz da amostra não afeta a inclinação da curva (sensibilidade). Um erro proporcional determinado é introduzido quando as diferenças entre as duas matrizes afetam a sensibilidade, como ilustrado na figura.

5 Formas de calibração Para se avaliar se as diferenças entre as inclinações das curvas são significativas, pode se aplicar os testes estatísticos F e t.

6 Formas de calibração Quando o efeito de matriz é esperado e a matriz da amostra é conhecida, pode-se realizar uma curva por ajuste de matriz (matrix matching). Neste método de calibração, a matriz da amostra é adicionada nos padrões de calibração de modo a se compatibilizar a matriz e minimizar os erros. Obs: nem sempre se consegue realizar o ajuste de matriz, pois muitas vezes é difícil obter a matriz sem o analito.

7 Formas de calibração 2º - Adição de padrão
É uma forma de calibração muito utilizada quando se tem efeito de matriz e não é possível realizar o ajuste de matriz. Neste método de calibração, quantidades conhecidas do analito são adicionadas a balões contendo volumes fixos da amostra. Posteriormente, o volume do balão é completado com um diluente adequado (água, ácidos diluídos, solventes orgânicos, etc.) As respostas instrumentais são obtidas para cada uma das soluções e se obtém a relação linear entre a quantidade de analito adicionada e a resposta instrumental.

8 de uma curva de calibração por adições de padrão
Formas de calibração 2º - Adição de padrão Exemplo do preparo de uma curva de calibração por adições de padrão

9 Formas de calibração 2º - Adição de padrão Cuidados
Deve-se ter uma idéia da concentração do analito na amostra para se definir a alíquota da amostra a ser tomada e as adições do padrão que serão realizadas. A faixa linear da técnica de medida deve ser respeitada, ou seja, a soma da concentração do analito na amostra e da adição do padrão no último ponto deve ser menor que limite da faixa linear.

10 Formas de calibração 2º - Adição de padrão Cálculo
Extrapolação no gráfico ou Utilizar a equação linear e calcular x quando y = 0

11 Formas de calibração 2º - Adição de padrão
Como a curva de calibração por adição de padrão é construída na amostra, ela não pode ser estendida para a análise de outras amostras. Desta forma, para cada amostra deve-se construir uma curva de calibração. Este fato dificulta a aplicação deste método de calibração para análises de rotina, onde um grande número de amostras precisa ser analisado. O método de adições de padrão pode ser utilizado para checar a validade da curva de calibração por padrões externos (avaliação do efeito de matriz).

12 Formas de calibração 3º - Padrão Interno
O sucesso da utilização dos métodos de calibração com padrões internos e de adições de padrão depende da habilidade do analista manusear amostras e padrões reprodutivelmente e da estabilidade do equipamento. Quando o procedimento não pode ser controlado de forma que todas as amostras e padrões são tratados igualmente, a exatidão e precisão do método podem ser comprometidos. Nos casos onde o processo analítico não é reprodutível, a padronização é possível se o sinal do analito for referenciado ao sinal gerado por outra espécie que foi adicionada em concentração fixa e conhecida em todos os padrões e amostras. A espécie adicionada é chamada de padrão interno e deve ser essencialmente diferente do analito.

13 Formas de calibração 3º - Padrão Interno

14 Formas de calibração 3º - Padrão Interno
Desde que o analito e o padrão interno em qualquer amostra ou padrão recebem o mesmo tratamento e estão sujeitos as mesmas variações, a razão dos sinais não será afetada. Se uma solução contem um analito de concentração CA e um padrão interno de concentração CPI, então o sinal devido ao analito, SA, e ao padrão interno, SPI, são: SA = kACA e SPI = kPICPI Sendo kA e kPI, as sensibilidades do analito e do padrão interno Para se facilitar a aplicação do padrão interno, plota-se a curva de calibração relacionando-se a razão sinal do analito (SA)/sinal do padrão interno (SPI) X a concentração do analito (CA) Para se obter a concentração do analito na amostra, basta utilizar a razão sinal do analito na amostra/sinal do padrão interno e jogar na equação da curva de calibração.

15 Formas de calibração 3º - Padrão Interno Características desejáveis:
Ter comportamento semelhante ao do analito de interesse, de forma a estar sujeito as mesmas interferências e flutuações que o analito. Ser detectado simultaneamente ao analito (técnicas multielementares) e ter sinal distinto do sinal do analito. Idealmente não estar presente na amostra (adiciona-se uma quantidade conhecida e constante) em todas as soluções (brancos, padrões, amostras).

16 Exemplo Na determinação de anfetaminas em urina por HPLC, a efedrina foi utilizada como padrão interno. Os dois compostos apresentam tempos de retenção distintos. Os resultados obtidos para a curva de calibração, branco e amostra são apresentados abaixo:

17 Resumo Métodos espectrométricos e cromatográficos Formas de calibração
1º - Padrões externos Concentração (crescente) x Resposta Instrumental Curva de calibração Inclinações das curvas avaliadas pelos testes estatísticos F e t. C RI Curva de calibração com adição de matriz Tcalc > Ttab as média diferem Tcalc < Ttab as médias não diferem Curva com ajuste de matriz 2º - Padrões internos Quando não existir matriz sem o analito Adição de Padrão PI adicionado em todas as soluções (brancos, padrões, amostras) Estratégia para melhorar a exatidão e precisão

18 Parâmetros para calibração
Coeficiente de correlação – utilizado para estimar o ajuste dos pontos experimentais à linha que é utilizada para estabelecer a relação linear. -1 ≤ r  +1

19 Exemplos Em química analítica normalmente se trabalha com valores de r > que 0,99 (em módulo)

20 Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados
Modelo simplificado: Assume-se que as quantidades ou concentrações das amostras de calibração são tomadas como “verdadeiras” e isentas de erro, ou então admite-se que os erros aleatórios de x são desprezíveis em relação aos de y. Nessas condições, deve-se usar a função de calibração: y = Bx + Axx + ey - Assume-se que os erros (s) são constantes em todos os pontos da calibração (Homoscedasticidade)

21

22 Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados
Calcula-se: A inclinação: A = Qxy/Qxx O intercepto: B = y – Ax O desvio padrão da regressão (desvio dos resíduos):

23 Calculando os termos:

24 Desvio padrão da inclinação:
Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados Desvio padrão da inclinação: Desvio padrão do intercepto:

25 Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados
Os desvios padrão podem ser utilizados para estabelecer o intervalo de confiança que contem a verdadeira inclinação e o verdadeiro intercepto: βA = A ± tsA βB = B ± tsB Podem ser utilizados também para comparar curvas no estudo de efeito de matriz.

26 Exercício Soluções padrão aquosas de fluoresceína foram analisadas em um espectrofluorímetro e as seguintes intensidades foram obtidas: Calcule o coeficiente de correlação,a inclinação e o intercepto, os respectivos desvios padrão e o intervalo de confiança Conc.(pg/ml) intensidade 2,1 2 5,0 4 9,0 6 12,6 8 17,3 10 21,0 12 24,7

27 Calculando... xi = 42 yi = 91,7 yi2 =1619,6 xiyi = 766,4
xyi xi2 2,1 4,41 2 5 25 10 4 9 81 36 16 6 12,6 158,8 75,6 8 17,3 299,3 138,4 64 21 441 210 100 12 24,7 610,1 296,4 144 xi = 42 yi = 91,7 yi2 =1619,6 xiyi = 766,4 (xi2) = 364

28 Calculando....

29 Pelo Excel....


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