Universidade de São Paulo Centro de Energia Nuclear na Agricultura

Apresentação em tema: "Universidade de São Paulo Centro de Energia Nuclear na Agricultura"— Transcrição da apresentação:

1 Universidade de São Paulo Centro de Energia Nuclear na Agricultura
CEN Biogeoquímica do Nitrogênio em Ecossistemas tropicais Aluna: Marcela Arnaldo Mestrado em Ciências (PPG CENA/USP) Área de concentração: Biologia na Agricultura e no Ambiente

2 Introdução Microrganismos do solo: mineralização da matéria orgânica.
Influência sobre a produtividade em sistemas agrícolas: degradam os resíduos e disponibilizam nutrientes essenciais para as plantas (ex: Nitrogênio). Resíduos de culturas: diferem quanto a decomposição (relação C/N, tipos de compostos etc.). Processos pouco compreendidos em agro-ecossistemas tropicais Identificação dos microrganismos envolvidos: possibilita manejo com o objetivo de preservar a produtividade

3 Introdução SIP (Stable Isotope Probing)
Permite determinar os microrganismos envolvidos num processo

4 Aumento na concentração de reagentes desnaturantes
Introdução Gene RNAr 16S: espécies ≠  sequências ≠ DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Separa sequências diferentes, de acordo com a composição de bases (A, T, C e G) Aumento na concentração de reagentes desnaturantes DGGE Espécie 1 Espécie 2 Espécie 3 Fração Leve Fração Pesada SEQUENCIAMENTO DAS BANDAS Identificação das espécies microbianas

5 Objetivo Identificar as bactérias envolvidas na degradação de resíduos de milho e soja, os quais apresentam características bioquímicas contrastantes.

6 Materiais e Métodos Preparo de materiais e obtenção de amostras
Resíduos vegetais de milho e soja Preparo: solução com 15NH415NO3 (99 átomos %) ou 14NH414NO3 por 75 dias – espectrômetro (NOI-6EPC)  marcados: 90 átomos % Solo Tipo de solo: Vertissolo  0-20 cm de área experimental (estado de Aragua, Venezuela). Características: 15,2 g kg−1 de Corgânico, 1.4 gN kg−1, pH (H2O) 6.7 e textura argilosa (7% areia, 35% silte e 58% argila). Resíduo Ntotal C:Ntotal Lignina : Ntotal Celulose Milho 1,21% 32 2,2 24,9% Soja 2,71% 15 1,1 15,5%

7 Materiais e Métodos Montagem do experimento de incubação
Tratamentos (em triplicata) 100g de solo + 1 g de resíduo de soja marcado (15N) 100g de solo + 1 g de resíduo de soja não-marcado 100g de solo + 1 g de resíduo de milho marcado (15N) 100g de solo + 1 g de resíduo de milho não-marcado 100 g de solo sem adição de resíduo Incubação 15 dias a 25°C Umidade controlada (40% C. C.)

8 Materiais e Métodos SIP Extração de DNA Ultracentrifugação
0,3g de solo  “FastDNA Spin Kit” (MP Biomedicals) Ultracentrifugação DNA em tubos com solução de CsCl  g por 69 horas Separação das frações Parte do gradiente contendo DNA  6 frações Para cada fração: concentração de DNA e enriquecimento em 15N (analisador elementar Euro EA 3000 acoplado a espectrômetro de massas de razão isotópica DeltaPlus XP)

9 Materiais e Métodos DGGE Amplificação do gene RNAr 16S Gel
Reação de PCR, utilizando DNA de cada fração Gel Poliacrilamida (6%) com gradiente variando entre 40 e 70% Bandas que apresentaram padrões diferentes entre os tratamentos  sequenciamento Comparação das sequências com as de bancos de dados  identificação da espécie

10 Resultados SIP Separação do DNA de acordo com a densidade
Fig 1. Gradientes de densidade em CsCl do DNA do solo não marcado e marcado com 15N quinze dias após a aplicação dos resíduos (A - milho; B - soja), mostrando as concentrações de DNA (ng µL-1) como medida das três replicatas para todas as frações analisadas (#1 ‘pesada’ a #6 ‘leve’) assim como o enriquecimento em 15N (atom%) nas frações.

11 Fig 1. Gradientes de densidade em CsCl do DNA do solo não marcado e marcado com 15N quinze dias após a aplicação dos resíduos (A - milho; B - soja), mostrando as concentrações de DNA (ng µL-1) como medida das três replicatas para todas as frações analisadas (#1 ‘pesada’ a #6 ‘leve’) assim como o enriquecimento em 15N (atom%) nas frações.

12 Resultados DGGE Fig 2. Padrões de DGGE do gene RNAr 16S obtido das frações de DNA ao longo do gradiente de densidade em CsCl (#1 ‘pesada’ a #6 ‘leve’) dos controles não marcados e dos tratamentos com resíduos marcados com 15N de milho (A) e soja (B). C- controle sem nenhuma aplicação de resíduo; M- solo tratado com resíduo de milho sem passar pela centrifugação; S- solo tratado com resíduo de soja sem passar pela centrifugação. Flechas indicam bandas selecionadas para o sequenciamento.

13 Resultados Sequenciamento de bandas
Tabela 1. Atribuição filogenética das sequências do gene RNAr 16S obtidas de quatro bandas de DGGE selecionadas (M1-M4; S1-S4) na fração ‘pesada’ #1, do experimento com resíduo enriquecido em 15N

14 Discussão Conclusões Dificuldades
Metodologia permitiu detectar as espécies bacterianas envolvidas na decomposição dos resíduos orgânicos Características bioquímicas dos resíduos induzem resposta de membros específicos da comunidade microbiana Dificuldades Determinar quantidade de resíduo a ser adicionada Tempo de incubação Necessidade de material altamente enriquecido

15 Análise do artigo Pontos positivos Pontos negativos
Metodologia adequada (uso de 15N) Reconhecimento das limitações Discussão cuidadosa Pontos negativos Falta de alguns detalhes da montagem do experimento Teste de uma única condição de incubação Não discute sobre as possíveis aplicações do conhecimento gerado

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