PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA PARA TRIAGEM DE PROMOTORES UTILIZANDO GENES REPÓRTERES DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES EM Saccharomyces cerevisiae Elizabeth dos Reis.

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1 PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA PARA TRIAGEM DE PROMOTORES UTILIZANDO GENES REPÓRTERES DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES EM Saccharomyces cerevisiae Elizabeth dos Reis Mazoni Andrade Orientadora: Dra. Mônica Bucciarelli Rodriguez Belo Horizonte Departamento de Biologia Geral Instituto de Ciências Biológicas 2002

2 Métodos para Análise da Expressão Gênica
Investigação da Expressão Gênica Sequenciamento completo LEVEDURAS Métodos para Análise da Expressão Gênica Microarranjos de DNA Exposição diferenciada Análise Seriada da Expressão Gênica Genes Repórteres

3 PROMOTORES Estrutura de promotores
Promotores transcritos por RNA polimerase II: Estrutura de promotores Elementos básicos: PIC (TATA box), Inr, DPE Elementos regulatórios: UAS, URS, poly(dA-dT) HSF POL II HSP82 TATAAA HSE1 HSE2 HSE3 TFIIF TBP TFIIA TFIIB TFIIE TAFs

4 FUSÃO GÊNICA Fusão transcricional Fusão traducional Gene Repórter
Promotor Fusão traducional Gene Repórter Promotor Met

5 LacZ GENES REPÓRTERES Beta-galactosidase Escherichia coli

6 GFP EGFP yEGFP Aequorea victoria Otimização de códons Ser-65 THr
Phe Leu yEGFP Otimização de códons

7 Discosoma sp. DsRed

8 SISTEMA REGULADO POR TETRACICLINA
Promotor tetO-CYC1/tetR-VP16/lacZ tetR VP16ad tet07 CYC TATA lacZ tTAtransativator 7 Tet0 box lacZ TRP1 Apr pCM173 10683 bp

9 SISTEMA SEM TETRACICLINA
VP16ad tetR VP16ad tet07 CYC TATA lacZ

10 SISTEMA COM TETRACICLINA
VP16ad tet07 CYC TATA lacZ

11 Sistema de triagem de promotores em Saccharomyces cerevisiae

12 Vetor para a biblioteca

13 Caracterização dos Genes Repórteres
Avaliação da meia vida de genes repórteres Sistema regulado por tetraciclina

14 Determinação da meia vida da expressão de lacZ

15 Fase exponencial de crescimento
Fase estacionária de crescimento

16 Fase exponencial de crescimento
Fase estacionária de crescimento

17 Avaliação do efeito do bloqueio da tradução sobre a atividade proteolítica

18 Fase exponencial de crescimento
Fase estacionária de crescimento

19 Avaliação da meia vida da expressão de proteínas fluorescentes

20 Construção dos plasmídios com as proteínas fluorescentes
yEGFP pCM173-yEGFP y EGFP pCM173-EGFP Construção dos plasmídios com as proteínas fluorescentes DsRed pCM173-DsRed

21 DsRed

22 EGFP

23 yEGFP

24 Número de células fluorescentes de acordo com a fase de crescimento da levedura

25 Avaliação da expressão de lacZ utilizando MUG como substrato

26 Fase estacionária Fase exponencial

27 Aspectos da utilização de genes de proteínas fluorescentes como repórteres para a triagem de promotores

28 ESTABILIDADE MATURAÇÃO

29 Visualização da produção de beta-galactosidase de acordo com o tempo

30 Experimentos utilizando meio SD
Número de células Número de células viáveis Unidades de beta-gal Experimentos utilizando meio SD Experimentos utilizando meio SD drop-out

31 CONCLUSÕES

32 O uso do sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter lacZ para visualização da meia vida da expressão de um gene repórter em Saccharomyces cerevisiae se mostrou viável para beta-galactosidase e pode ser utilizado para basicamente qualquer proteína em levedura. A utilização do sistema de bloqueio geral da tradução para visualização da meia vida de um gene repórter em Saccharomyces cerevisiae fornece um resultado mais longo que o real, devido ao bloqueio da tradução de proteínas proteolíticas. O uso de repórteres para triagem de promotores em diferentes fases de crescimento da levedura deve levar em conta que a meia vida do fenótipo é diferente. Existe uma regulação, durante as fases de crescimento da levedura, do sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter A presença de atividade detectável do gene repórter em apenas uma parcela das células albergando o sistema promotor tet0-CYC1/ativador tetR-VP16/gene repórter, é uma característica própria deste sistema

33 AGRADECIMENTOS