Enzimas de Restrição.

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1 Enzimas de Restrição

2 Tópicos a abordar Diferentes tipos de enzimas de restrição (tipo I, II, III) Enzimas do tipo II e sequências de reconhecimento (4, 6, 8 nts) Izosquizômeros e enzimas compatíveis Hidrólises múltiplas Aplicações em engenharia genética Mapas de Restrição

3 ~1940 – Experiências com bacteriófagos
Nota Histórica 1978 1950 1956 1970 1940 1966 2006 1953 1972 ~1940 – Experiências com bacteriófagos 1972 – Primeiras experiências com DNA recombinante (Berg & Boyer) 1978 – Isolamento e caracterização de mais de 200 enzimas de restrição Prémio Nobel – W. Arber, H. Smith e D. Nathans ~1950 – Diferentes eficácias de infecções por parte dos bacteriófagos. Variações entre estirpes bacterianas. 1953 – Estrutura do DNA (Watson Crick) 1956 – Isolamento da DNA polimerase (Kornberg) 1966 – Isolamento da DNA ligase (Weiss & Richardson) in educar.sc.usp.br 1970 – Purifica-se a primeira enzima de restrição tipo II: o Hind II (Smith & Wilcox)

4 Enzimas de restrição Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em pontos específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases - palíndromas in educar.sc.usp.br

5 Enzimas de restrição Enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de vírus invasores Diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de bases de DNA Ajuda a detectar a presença de diferentes formas de determinados genes in 1fiuA-1crf_-active

6 1º enzima a ser descoberta nesta bactéria
Nomenclatura As enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria que a produziu Exemplo: EcoR I Ordem de descoberta Género Estirpe Espécie Escherichia coli RY 13 1º enzima a ser descoberta nesta bactéria

7 Sistemas de Restrição - Modificação
Mecanismo de defesa presente quando da entrada de DNA fágico na célula Combinação de enzimas de restrição com metilases hidrólise do DNA “estranho” protecção do DNA celular relativamente as enzimas de restrição através da adição de grupos metil às bases A ou C DNA metilase possui a mesma sequência de reconhecimento que os enzimas de restrição Existem raras exceções em que a metilação pode provocar a activação do enzima de restrição

8 Sequências de reconhecimento
Não ambíguas Exemplo: BamHI - só reconhece a sequência GGATCC CCTAGG Ambíguas Exemplo: HInf I - reconhece sequências de 5bp começadas por GA e que terminem em TC

9 Tipos de enzimas de restrição
Classificação baseada em: Composição da sequência nucleotídica Posição de clivagem Sequência de reconhecimento Co-fatores envolvidos in Lenhinger Principles of Biochemistry Estrutura da enzima em causa

10 Tipos de enzimas de restrição
Tipo I 3 subunidades: 1 subunidade de restrição (“R”) 1 subunidade de metilação (“M”) 1 subunidade de reconhecimento (“S”) Sequência de reconhecimento é assimétrica Local de hidrólise não é específico e ocorre a mais de 1000 bp de distância Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP Impede o seu uso em engenheira genética

11 Tipo III 2 subunidades: 1 subunidade de restrição (“R”)
1 subunidade de metilação e reconhecimento (“MS”) Sequência de reconhecimento é assimétrica (5-7 bp) Dupla cadeia de DNA hemimetilada Local de hidrólise a mais de bp de distância Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP Impede o seu uso em engenheira genética

12 Tipo II Duas enzimas: 1 enzima de restrição (Endonuclease)
1 enzima de metilação (Metilase) Estrutura com 4 folhas β e 1 hélice α Sequência de reconhecimento é palindrómica 4-8nts Hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da sequência reconhecida Não necessita de ATP, apenas Mg2+ Importantes na recombinação genética e na elaboração de mapas de restrição (especificidade de corte)

13 Sequência de reconhecimento
Izosquizômeros Diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma sequência de reconhecimento Diferem nas condições ótimas de reação, na estabilidade Exemplo: Enzimas de restrição Sequência de reconhecimento SacI GAGCTC CTCGAG SstI

14 Sequência de reconhecimento
Enzimas compatíveis DNA recombinado com sequência híbrida Sobreposição parcial de sequências de reconhecimento Produzem extremidades protuberantes compatíveis Exemplo: Enzimas de restrição Sequência de reconhecimento BamHI GGATCC CCTAGG BglII AGATCT TCTAGA

15 Factores que influenciam a atividade das enzimas de restrição:
Composição do tampão Diferem na força iónica (concentração de sal) Diferem no catião principal (Na+ ou K+) Solução: Manter o pH da reacção (geralmente em 8.0) Temperatura de incubação A maioria das enzimas cliva melhor a 37ºC Excepções: Bactérias termofílicas – clivam melhor entre 50 a 60ºC Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37ºC, recomenda-se a incubação a 20ºC Influência da metilação no DNA Existe algumas endonucleases de restrição que não clivam DNA metilado Digestão com múltiplas enzimas

16 Hidrólise Enzimática As endonucleases de restrição do tipo II ligam-se ao sulco maior da forma b-DNA Dois tipos de ligação: não específica e específica A ligação não específica permite à enzima ‘deslizar’ pela cadeia ligada apenas ao ‘backbone’ da molécula de DNA A ligação específica leva à alteração da dupla hélice de DNA, para aproximar melhor as bases dos centros catalíticos A metilação de uma base impede a ligação específica e a formação do complexo

17 Hidrólise Enzimática A hidrólise dá-se ao nível das ligações fosfodiéster Mg2+ é um cofator essencial, mas pode ser substituído por certos cátions divalentes, como Mn2+ Produtos da hidrólise resultam em extremidades 3’-OH e 5’-P 5’ 5’ 3’ 3’

18 Hidrólise Enzimática A cadeia de DNA pode ser hidrolisada para dar origem a pontas cegas (“blunt ends”) ou pontas coesivas (“sticky ends”) Duas cadeias com pontas cegas podem ser unidas por uma DNA-ligase, mesmo sendo de origens diferentes Uma cadeia com pontas coesivas liga-se com maior facilidade a cadeias com sequências complementares

19 Hidrólise Enzimática Extremidade cega (blunt ends)
Clivam as duas cadeias de DNA em ligações fosfodiéster opostas Extremidade coesiva (sticky ends) Clivagem assimétrica nas cadeias de DNA Pequeno número de nucleotídeos em cadeia simples, capazes de se associar por ligações de hidrogénio, com outra cadeia simples em que a sequência de bases seja complementar desta (annealing)

20 Hidrólise Enzimática Hidrólise simples:
A hidrólise enzimática pode ser simples ou múltipla dependendo do número de enzimas utilizadas na obtenção de fragmentos de DNA Hidrólise simples: Digestão do DNA com uma única enzima de restrição Determinação relativa das orientações dos fragmentos no DNA linear Hidrólise múltipla: DNA hidrolisado por mais que uma enzima de restrição Determinação das posições dos fragmentos no DNA, produzidos pelas enzimas, com a ajuda da eletroforese

21 Aplicações em Engenharia Genética
O termo “engenharia genética” inclui: métodos para a formação de combinações novas do material genético introdução e replicação do DNA recombinante numa bactéria para amplificar o gene Análise molecular da estrutura do cromossomo e do genoma (mapeamento, o grau de metilação) Caracterização fenotípica (manifestos ou latentes) de defeitos genéticos hereditários ao nível do DNA (RFLPs) Relacionamentos filogenéticos pela comparação de locais selecionados da restrição em genes essenciais. Clonagem de Genes

22 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Marcador de DNA Mutações em 2 alelos específicos de cada individuo em locais de restrição – polimorfismo: sequências diferentes de restrição diferentes tamanhos de fragmentos Muitas doenças humanas prejudiciais ou fatais caem nesta categoria

23 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Testes padrões do DNA das pessoas com doença Testes padrões do DNA de pessoas saudáveis (controlo) Banda igual Banda igual Banda comum em pessoas com doença Banda comum em pessoas saudáveis A existência de RFLPs fornece a base para estabelecer relacionamentos inequívocos de paternidade

24 Mapas de Restrição É uma compilação do número, da ordem e da distância entre locais do corte do enzima de restrição ao longo de um segmento clonado do DNA As unidades do mapa são expressadas em pares de bases ou para distâncias mais longas em pares de kilobases O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vector bem caracterizado do plasmídeo ou do bacteriófago, onde a sequência é conhecida Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um DNA desconhecido e um pré-requisito a manipulá-lo para outras finalidades.

25 Elaboração de Mapas de Restrição
Existem dois métodos para elaborar um mapa de restrição: mapeamento utilizando digestões múltiplas mapeamento utilizando digestões parciais Construção de mapas de restrição com hidrólises múltiplas: Hidrólise do DNA: separadamente com hidrólises simples e com pares de enzima Aplicar uma electroforese em gel para os fragmentos obtidos (Permite a separação dos fragmentos gerados de diferentes tamanhos!!!)

26 Elaboração de Mapas de Restrição
DNA não digerido Marcadores HindIII + SalI HindIII SalI 0.8 0.4 5.8 10.0 0.8 1.2 7.0 HindIII SalI Modelo I 8.0 7.0 6.2 5.8 5.8 5.0 0.8 5.0 1.2 2.5 1.2 1.0 0.8 0.8 0.5 0.4 0.8 5.8 7.0 HindIII Modelo II SalI

27 Digestão Parcial com marcação radioativa (32P) dos extremos do DNA
Mapas de Restrição Digestão Parcial com marcação radioativa (32P) dos extremos do DNA Fragmento de DNA marcado num dos extremos com um radioisótopo Pode ser parcialmente digerido com enzimas de restrição produzindo fragmentos marcados de tamanhos diferentes mas que revelam directamente onde são os locais de clivagem Digestão parcial surge em condições não ótimas para que ocorram um número limitado de hidrólises: período de incubação pequeno incubação a baixas temperaturas

28 Elaboração de Mapas de Restrição
Enzimas Nº de fragmentos Tamanho / kd XbaI 2 24.0, 24.5 XhoI 15.0, 33.5 KpnI 3 1.5, 17.0, 30.0 XbaI + XhoI 9.0, 15.0, 24.5 XbaI + KpnI 4 1.5, 6.0, 17.0, 24.0 Nº de sítios restrições de: XbaI – 1 É linear XhoI – 1 Tamanho do fragmento: 48.5 kd KpnI – 2

29 Elaboração de Mapas de Restrição
XbaI 24.0, 24.5 XhoI 15.0, 33.5 XbaI + XhoI 9.0, 15.0, 24.5 XhoI XhoI XbaI 9.0 15.0 24.0 15.0 9.0 24.5 48.5 Todos os locais de restrição do KpnI caem no fragmento da XbaI 24.5 kb, uma vez que o fragmento 24.0 kb continua intacto após a digestão dupla do XbaI-KpnI A ordem dos fragmentos do KpnI só pode ser determinado pela digestão parcial

30 Elaboração de Mapas de Restrição
Enzima Tamanho / kd KpnI – digestão parcial 1.5, 17.0, 18.5, 30.0, 31.5, 48.5 XbaI + KpnI 1.5, 6.0, 17.0, 24.0 Os fragmentos 1.5, 17.0 e 30.0kd são produtos da digestão completa Os fragmentos 18.5 e 31.5kd são produtos da digestão parcial XhoI XbaI KpnI KpnI’s 15.0 9.0 6.0 1.5 24.5 17.0 18.5 17.0 1.5 48.5

31 Elaboração de Mapas de Restrição
EcoRI BamHI HindIII HaeII EcoRI + HaeII BamHI + HaeII HindIII + HaeII EcoRI + HindIII EcoRI + BamHI BamHI + HindIII 12.0 6.0 4.0 2.0 5.0 1.0 1.5 0.5 2.5 6.5 5.5 10.5 8.0 HaeII (0/12.0) BamHI (11.5) EcoRI (1.0) É circular Tamanho: 12.0kd HaeII(10.0) 12.0kd HindIII (7.5) HaeII (6.0)

32 Elaboração de Mapas de Restrição

33 Elaboração de Mapas de Restrição

34 Elaboração de Mapas de Restrição

35 RAPD: randomly amplified polymorphic DNA
Size sorted

36 RAPD: randomly amplified polymorphic DNA
B

37 AFLP: amplified fragment length polymorphism
Digestão do DNA com 2 enzimas Ligação de adaptadores nos finais dos fragmentos PCR com primers adaptadores dos fragmentos

38 AFLP

39 VNTR: variable number tandem repeats
Regiões não codificadoras Muitas cópias de uma mesma sequência no genoma Alta taxa de variação entre indivíduos no número de cópias

40 Microssatélites VNTRs mais utilizados
Repetições de 2, 3, ou 4 pares de bases Próximo de 100 cópias aleatórias de cada Altamente variável Muitos loci diferentes de microssatélites (1000s) em diferentes espécies

41 Microssatélites

42 Microssatélites

43 Bibliografia Brown, T.A. (1998) Gene Cloning an introduction 3rd ed., Santley Thorner (Publishers) ltd, Manchester, UK Kulg; Cunnings (1997) Concepts of Genetics 5th ed., Internacional edition, Prentice Hall, USA Watson, James D. (1992) Molecular Biology of the Gene 3rd ed., Benjamin/Lumming, Harvard University and Cold spring Haba laboratory Lewin, Benjamin (1997) Genes VI Oxford University Press, Oxford, New York Gerhartz Wolfgang (1990) Enzymes in Industry – Production and Applications VCH, New York