Caracterização de genes de resistência a insetos

Apresentação em tema: "Caracterização de genes de resistência a insetos"— Transcrição da apresentação:

1 Caracterização de genes de resistência a insetos
Marcelo Menossi Laboratório de Genoma Funcional Centro de Biologia Mol. Engenharia Genética

2 Coffea arabica (75%) e Coffea canephora (25%)
Café no Brasil Coffea arabica (75%) e Coffea canephora (25%) 13 estados produtores 9 milhões de empregos diretos e indiretos 2 bilhões de dólares em receita 2 milhões de hectares 150 cooperativas e empresas exportadoras registradas 1.500 indústrias de torrefação e moagem Segundo país maior consumidor do produto

3 Estresse Biótico e o Café
Nematódeos Meloidogyne sp. Fungos Ferrugem do café (Hemileia vastatrix) Insetos Broca do Café (Hypothenemus hampei) Bicho mineiro (Leucoptera coffeella)

4 Ciclo de vida do bicho mineiro
Incubação dos ovos à eclosão Das lagartas - 4 a 6 dias Desenvolvimento da lagarta - 7 a 11 dias (dano) Mariposa Oviposição  Formação da crisálida Eclosão da lagarta Duração da fase pupal – 5 a 8 dias Duração da fase adulta - 5 a 20 dias (fêmeas)

5 Cultivares resistentes
Instituto Agronômico de Campinas - Hibridações entre C. arabica e C. racemosa (resistente) - Avaliação da quinta geração de retrocruzamentos Indivíduos resistentes e suscetíveis

6 Defesas contra herbivoria
Defesa Constitutiva- Barreiras Físico-químicas Defesa Induzida - Expressão gênica Transdução de sinal Reparação do tecido Ajuste metabólico Inibição do crescimento do predador

7 Objetivos Identificar e caracterizar a expressão de genes que possam estar relacionados com a expressão da resistência do cafeeiro ao bicho-mineiro Avaliar esses genes como possíveis marcadores moleculares de resistência ao bicho-mineiro

8 Arranjos de DNA Arranjos em lâmina - Microarrays
Arranjos em membrana - Macroarrays

9 Arranjos de DNA * * * * * * * * * * * * * Hibridação Detecção do sinal
Macroarray A1 Macroarray A2 768 ESTs duplicata 12 x 8,5 cm Hibridação * * * * * * * * * * * Sonda células controle Sonda células tratadas * * Detecção do sinal e análises

10 Bibliotecas de subtração
Enriquecidas em cDNAs diferencialmente expressos Driver Tester genes sem interesse genes de interesse Driver Driver e Tester Tester Sem amplificação Amplificação Exponencial Amplificação Linear Tester Enriquecido Eliminado

11 Avaliação do nível de resistências das plantas
Resultados Avaliação do nível de resistências das plantas Resistentes 1 2 Suscetíveis 3 4

12 Experimento de infestação
Controle (sem infestação) Rc e Sc Resistentes e Suscetíveis 3 dias pós infestação (oviposição) Ro e So 7 dias pós infestação (eclosão) Re e Se R S C O E C O E

13 Estratégia - Biblioteca de Subtração
Resistente controle Suscetível controle Suscetível após oviposição Suscetível após eclosão Resistente após oviposição + Resistente após eclosão Tester (genes de interesse) Driver (genes descartáveis) Genes induzidos preferencialmente nas resistentes pós infestação

14 Único ciclo de subtração Efeito de normalização
Resultados subtração DP1 DP2 DP3 Representational Diference Analysis (RDA) Vários ciclos de subtração Não normalizada Supressive Subtraction Hybridization (SSH) RDA: 100 ng Tester e 10 g Driver SSH: 10 ng Tester e 0,52 g Driver Único ciclo de subtração Efeito de normalização

15 Resistente - pós eclosão
Hibridação com sondas de cDNA Resistente - controle Resistente - pós eclosão Membranas de náilon contendo 768 clones da biblioteca de subtração, hibridadas com sondas de cDNA

16 Análise dos dados Normalização - Fator normalizador: intensidade do background das membranas em regiões que não continham spots Seleção - spots réplica apresentaram intensidade maior que 10% do background e com variação de sinal menor que duas vezes entre spots réplicas Cálculo da média entre spots réplicas ESTs cujo valor máximo das médias dos spots de um dos tratamentos com cDNA de plantas resistentes infestadas (Ro ou Re) for maior que duas vezes o mínimo de um dos outros tratamentos (Rc, Sc, So ou Se)

17 SOM- Self Organizing Maps
260 ESTs selecionados. C O E C O E Res Sus

18 Genes Induzidos (exemplos)
16,5% de clones de RDA (143) – alta redundância 17 % dos clones do SSH (117) – baixa redundância

19 Confirmação por northern blot
Rc Ro Re Sc Se So SSH 101B04 SSH 201D09 SSH 104G04 SSH 202H06 SSH 202C10 DP3 102B11

20 260 genes diferencialmente expressos
Análise da estratégia Subtração + Macroarray RDA- Ideal para amostras com diferença de indução de 10x SSH- Ideal para amostras contendo muitos transcritos diferencialmente expressos Falso positivos ? Tente conhecer seu modelo experimental 260 genes diferencialmente expressos

21 METABOLISMO SECUNDÁRIO DE AMINOÁCIDOS, AÇÚCARES E VITAMINAS
Modelo inicial das defesas da planta Epiderme Mesofilo METABOLISMO SECUNDÁRIO TRÁFICO INTRACELULAR PROTEÓLISE Peptidase sinal SECY Metaloprotease Fosfocitidil sintase Flavonol transferase GTPase, Quinases, Trocador Na/Ca ? TRANSDUÇÃO DE SINAL FATORES DE TRANSCRIÇÃO MYB, Homeoproteína BELL Oviposição PROTEÍNAS EFETORAS ESTRESSE OXIDATIVO Eclosão Quitinases Inibidor de protease GST Catalase psaH FUNÇÃO DESCONHECIDA ESTRESSE ABIÓTICO METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS, AÇÚCARES E VITAMINAS No hits Unknown protein Proteína associada à senescência RD22 – Proteína anti-seca Glutamato decarboxilase Tiamina sintase Acetil COA sintase

22 Próximas etapas Análise da expressão dos genes diferencialmente expressos Análise de segregação em Southern blot de plantas resistentes e suscetíveis

23 CNC PNP&D Equipe IAC CBMEG - Unicamp http://cafe.cbmeg.unicamp.br
Dr. Oliveiro Guerreiro Filho Dra. Míriam Maluf Daniel Ramiro (MSc.) Silvia Chebabi (M.Sc.) IMECC – Unicamp Dr. Aluisio S. Pinheiro IQ-USP Prof. Dra. Mari Cleide Sogayar Dr. Mario Henrique Bengtson Christian Colin (Dr.) CBMEG - Unicamp Jorge Mondego (Dr.) Juliana de Maria Felix (Dr.) Rodrigo Drummond (Dr.) Renato Vicentini (IC) Cristiane Rocha (IC) Melina P. Duarte (IC) Dr. Marcelo Menossi CNC PNP&D União Européia