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Anotação de SAGE Tags Rodrigo Martins Brandão
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SAGE A Bioinformática têm papel essencial para o SAGE em três funções básicas: extração e gerenciamento dos dados anotação das tags análise estatística (distribuição e comparações)
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SAGE Experimento de SAGE Contagem das Tags Anotação das Tags Análise
dos dados
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Extração das Tags Dados estão no formato de cromatogramas
Software de Base Calling (Ex.: Phred) para gerar a sequência do concatâmero no formato texto com seu valor de qualidade Extração e contagem das tags
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Contagem das Tags Localizar CATG Extração dos Ditags (20 – 26 pb)
Descartar ditags duplicadas Obter as 10 bases extremas, sendo reverso complementar a da direita Descartar adaptadores (linkers) de sequências Contagem das tags
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Extração das Tags ----CATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATG---- ----GTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTAC----
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Exemplo >SAGE-WT1-A0001-A01.abd 1047 0 1047 ABI
GGCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA TTGGGCCCTCTAATGCATGTTGACGTGCACTTCC GTAGCCTCATGTTTTATGGAATCACCTATTATGCCA TGACTTTTTCAAAACTAGGCTGTGCCATGTTTACA CAGTATGCACACATCTTCCATGGATGTGGACAGA AAATCCTCCAACATGATGGCAA A tag em azul deverá ser a reversa complementar da sequência.
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Contagem das Tags Softwares que fazem a extração e contagem das tag:
SAGE 300 – Zhang et al. (1997) SAGE 2000 – Invitrogen, Inc. (I-SAGE) eSAGE – Margulies & Innis (2000) USAGE (On-line) – van Kampen el at. (2000) SAGEnhaft (On-line) – Beissbarth et al. (2004)
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SAGE Experimento de SAGE Contagem das Tags Anotação das Tags Análise
dos dados
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Anotação de SAGE Tags A anotação (ou mapeamento) das SAGE tags, nos permite dar sentido biológico aos resultados ao identificar uma tag.
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Anotação de SAGE Tags Tag, etiqueta, marcador, assinatura...
É uma sequência de nucleotídeos de pb. Uma Tag possui informação suficiente para a identificação de um transcrito único.
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Anotação de SAGE Tags Mais de 1 gene pode estar relacionado a mesma tag; 1 gene pode estar relacionado a 1 ou mais tags diferentes;
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Principais Problemas Erros de amostragens; Erros de sequênciamento;
Possibilidade de tags não unívocas; Transcritos que não geram tags utilizando uma dada enzima; Sequências repetitivas;
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Como Resolver? aumento do número de tags coletadas.
uso de tags mais longas. uso de diferentes enzimas de restrição.
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Preparar a bilioteca de SAGE
Anotação de SAGE Tags 1° Passo: Preparar a bilioteca de SAGE
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Biblioteca de SAGE Short SAGE: ~14 pb Long SAGE: ~21 pb
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Biblioteca de SAGE Short SAGE: Tag Freq. GCAGACCATA 1451
AACAGTTCCA GCCAACTCGG 2 CGTGCGGATT 1
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Biblioteca de SAGE Número de tags de uma biblioteca:
Soma das frequências de todas as tags Número de tags únicas de uma biblioteca quantidade de tags únicas existente
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Biblioteca de SAGE Quanto maior o número de bibliotecas de um mesmo organismo melhor. As bibliotecas devem ser normalizadas.
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Biblioteca de SAGE Gerar a lista das CSTs (Confident SAGE Tag):
Remover tags com frequência igual a 1; Remover linkers de sequências linkers com variação de 1pb AAAAAAAAAA – AAAAAAAAAT
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Extrair as Tags Virtuais
Anotação de SAGE Tags 2° Passo: Extrair as Tags Virtuais
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Anotação de SAGE Tags Tag Virtual: é uma “tag” extraída computacionalmente. Encontrada nos 10 pb posterior ao sítio da enzima NlaIII na região 3' UTR em mRNA.
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Extração das Tags Virtuais
O sítio da enzima NlaIII é identificado pelas bases CATG. 5' ' CGACGGTCATGAAATCGATACCGAAAAA
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Extração das Tags Virtuais
Cauda de Poli-A: quantidade de “A” nas ultimas bases. Sinal de Poli-A: AATAAA e ATAAAA nas últimas 50 bases.
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Relacionar as informações
Anotação de SAGE Tags 3° Passo: Relacionar as informações
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SAGE Tags x Tag Virtual Relacionar Tag ao Gene
Pode-se encontrar mais de uma tag relacionada a um mesmo gene. Qual a melhor Tag para o Gene? Ranking Tag com alta expressão (Maior pontuação). Tag virtual interna (Menor pontuação).
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Ranking a tag mais próxima a região 3' de mRNAs com cauda poli- A;
a tag mais próxima a região 3' de ESTs com cauda de poli- A (ou cabeça de poli-T); a tag mais próxima a região 3' de mRNAs com sinal de poli- A; a tag mais próxima a região 3' de mRNAs sem sinal e sem cauda poli-A; tags internas (as tags de número 4, 3 e 2) de mRNAs;
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Extração das Tags Virtuais
Onde encontrar os transcritos? Banco de dados públicos: UniGene, RefSeq. Caso não tenha, pode-se usar organismo filogeneticamente próximos para obter uma anotação prévia.
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Links SAGEmaphttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SAG E
SAGEGenie
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