Alterações no perfil de expressão gênica

Apresentação em tema: "Alterações no perfil de expressão gênica"— Transcrição da apresentação:

1 Alterações no perfil de expressão gênica
e do imunofenótipo de CPHs CD34+ expandidas ex vivo Dalila Zanette Panepucci RA, Molfeta GA, Araujo AG, Silva-Jr WA, Palma PBV, Menezes CCBO, Delgado MO, Covas DT Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Zago

2 Transplante de células progenitoras hematopoéticas de SCU
Menos utilizadas do que medula óssea ou sangue periférico mobilizado Baixo numero de células Afeta diretamente o sucesso do transplante

3 Expansão in vitro: várias tentativas
Células expandidas apresentam menor enxertia Perda da capacidade de repopulação in vivo ?????

4 Maior obstáculo da expansão
TER PROLIFERAÇÃO Preservar auto-renovação Evitar a diferenciação A PRÓPRIA PROLIFERAÇÃO ESTIMULA A DIFERENCIAÇÃO E A PERDA GRADUAL DA CAPACIDADE DE REPOVOAR

5 Na ausencia total de estroma: perda gradual da capacidade de repovoar
Maior obstáculo da expansão Melhores resultados até hoje: CPHs co-cultivadas com estroma humano Na ausencia total de estroma: perda gradual da capacidade de repovoar Quais os genes envolvidos nesta perda ? Quais os genes afetados pela ausência do estroma ?

6 Objetivos

7 Objetivos Avaliar os efeitos da expansão sobre a expressão gênica de células CD34+ Avaliar os mecanismos genéticos envolvidos na adaptação ao meio ex vivo na ausência de estroma Como estas mudanças alteram a capacidade de repovoar e a capacidade de diferenciação das células expandidas

8 MNC CD34+ Células recém-isoladas T0 - CD 34 pureza - Imunofenótipo
- Viabilidade - CFC ensaios clonogênicos - RNA : microarrays e qPCR MNC CD34+ Células expandidas por 3 dias T3 - Imunofenótipo - Viabilidade - CFC ensaios clonogênicos - RNA : microarrays e qPCR 3 dias de cultivo

9 Free Style Medium (Invitrogen)
Protocolo de expansão utilizado Free Style Medium (Invitrogen) 1% de human albumin TPO FLT3 lig SCF IL-6 Sem estroma e sem soro bovino fetal 3 dias

10 Microarrays de oligonucleotídeos: plataforma Codelink
Cerca de genes/transcritos

11 Microarrays de oligonucleotídeos: plataforma Codelink
13 amostras T0 T3 Freshly isolated In vitro Expanded for 3 days 2 pools 2 pools Reguladas POSITIVAMENTE pela expansão Reguladas NEGATIVAMENTE pela expansão

12 Resultados e Discussão

13 Mais de 75% de viabilidade
Viabilidade celular Mais de 75% de viabilidade No dia 3 t0 : média 63% viáveis t3 : média 75% viáveis t7 : média 54% viáveis

14 Expressão gênica In vitro:
Quais as diferenças na expressão gênica de células CD34+ recém-isoladas e expandidas ex vivo ?

15 Microarrays : 40 genes mais expressos em T3
Razão UBTD1 126,3 TAS2R1 21,9 PACSIN3 15,8 AMBP 12,0 GSS 110,2 STAT2 21,7 PCK2 15,2 PLK1 11,8 ANGPTL3 66,6 PIH1D1 19,8 P2RX7 14,4 USP2 11,2 BBC3 60,2 AFG3L2 19,7 XPO7 14,2 IL9R 10,9 ADAM18 52,1 ITIH1 17,9 MRC1 13,9 CYLC1 10,8 CAMK4 48,7 WNT5B PHLDA2 13,4 RBP4 10,5 PHLDA1 42,1 ADAMTS10 17,3 TDRD6 13,1 BUB1 10,4 TOM1L1 33,1 KIF1B 16,6 GAL 12,1 HSD3B7 10,1 KIF2C 25,2 GMIP 16,3 SMAD6 PGF 10,0 INMT 24,2 FBLN1 DDX25 23,9 CD26 9,9

16 Genes validados e classes funcionais (Real Time qPCR)
Proliferation IL9R SMAD6 Apoptosis BIRC5 or survivin Cell cycle CDC25C CCND1 WNT pathway WNT5B WIF1 GSK3B Self-renewal HOXB4 Bmi-1 Polarity, cell division AKT1 PTEN Processos associados à expansão ex vivo e à auto-renovação

17 Via de sinalização WNT CANONICAL NONCANONICAL Beta-catenin dependent
Beta-catenin independent CANONICAL NONCANONICAL Katoh M and Katoh M, 2007

18 Via de sinalização WNT Canônica
Regula a escolha do destino das células progenitoras durante o desenvolvimento embrionário e também na homeostase dos tecidos adultos Não-Canônica - Regula indiretamente a escolha do destino das células progenitoras durante o desenvolvimento embrionário e também na homeostase dos tecidos adultos através da inibição da via canônica - Polaridade celular e migração celular

19 Via de sinalização WNT Via não-canônica
Não sinaliza através da beta-catenin; Em alguns casos inibe a via canônica; Também necessita de Fzd como receptor, mas não precisa de LRP5/6; A via NC, divide-se em 3 outras sub-vias: duas delas liberam íons Cálcio no citoplasma, que são a via da adesão e da morfologia celular. A terceira é a via da polaridade celular;

20 Via de sinalização WNT WNT1 (1,5) WNT2 (1,8) WNT2B (1,3) WNT3A (NA)
WISP2 (1,2) WISP3 (1,0) FZD9 (7,5) GSK3B (-1,1) CTNNB1 (-1,5) AXIN 2 (1) WIF-1 (-5) DKK1 (4,8) WNT5B Inibe a via canônica Ativa a via não-canônica ~WNT5A FZD9 Receptor WIF1 Inibidor das duas vias, canônica e não-canônica DKK1 Inibidor específico da via canônica

21 Via de sinalização WNT e polarização
Polarização de CPHs cultivadas in vitro: evento comum na ausência de estroma e na presença e citocinas Divisões assimétricas Perda da capacidade de repopulação Giebel et al, 2004 Giebel B and Bruns I, 2008

22 Divisões assimétricas
Via de sinalização WNT e polarização das CPH Via não-canônica WNT Polaridade Divisões assimétricas Outras vias regulam a polarização: PI3K-AKT Sinalização do Cálcio EGF Auto-renovação

23 Via de sinalização WNT e outras vias
Wnt and PI3K-AKT estão relacionadas em gliomas Pu et al, 2008 Não-canônica e PI3K-AKT Kawasaki et al, 2007

24 Dados divergentes sobre a via WNT e CPH
Nemeth et al, 2007 Wnt5a (não-canonica) : aumenta a atividade de repopulação das CPH Wnt3a (canônica) : não aumenta a enxertia Reya et al, 2003 A beta-catenina aumenta a auto-renovação in vitro Jeannet et al, 2007 A hematopoese a longo-prazo independe de cateninas

25 Via de sinalização WNT e CPH
Hipótese A via não-canônica está mais ativa nas células cultivadas ? Isso interfere na capacidade de repovoar destas células ?

26 Silenciamento do Wnt5b siRNAs para o silenciamento do gene WNT5b
faremos a cultura exatamente como antes, incluindo controles e também amostras nas quais o WNT5B será silenciado Avaliaremos se houve transfecção através de um controle fluorescente avaliaremos se houve silenciamento do gene por real-time PCR para o WNT5B Avaliaremos se a proteína WNT5B é alterada, com Ac anti-WNT5b

27 Silenciamento do Wnt5b Consequências
Na morfologia: verificar polarização Na expressão de marcadores de superfície Na expressão gênica de alvos abaixo de WNT e outros membros da via WNT (WNT5A, WNT8A, DKK1, GSK3B, beta-catenin, OCT3/4, NANOG, SOX2 e Axin 2) Na capacidade de formar colônias eritróides e mielóides Na proliferação das células

28 Divisão celular Genes mais expressos em CPHs cultivadas Fuso Mitótico
Organização do citoesqueleto Mitose Divisão celular Marcadores de superfície Polaridade Assimetria

29 Genes mais expressos em CPHs cultivadas : mitose
Quiescence abrogation

30 (+BIRC5, borealin, Incenp)
Genes mais expressos em CPHs cultivadas : fuso mitótico KIF2C KIF1B AURKB CPC complex (+BIRC5, borealin, Incenp) (p+) centrômeros KIF20A PLK1 Razões maiores do que 10 Fuso mitótico e centrossomos : interligam os eventos de : Divisões assimétricas, polaridade e auto-renovação

31 Validação dos genes mais expressos: qPCR

32 Validação dos genes da via WNT: qPCR

33 Validação de genes de auto-renovação : qPCR

34 Via não-canônica do WNT e expansão ex vivo
To confirm: Expressão de marcadores ee superfície Ensaios clonogênicos Proliferação Ciclo celular Polaridade Expressão dos alvos e outros membros da via não-canônica Silencing WNT5B (siRNA)

35 Microarrays : 10 genes menos expressos em T3
t0 / t3 GENE t0 / t3 AREG -431 ARHGAP20 -16 IFI44L -62 ELAVL4 -15 TPPP3 -57 VPREB3 CRTAC1 -53 CLEC4E -14 RGS1 -49 S100A12 CXCL10 -38 KLF2 -13 SNF1LK -37 CD69 SERPINA1 -25 RAG2 -12 CD20 -20 HIST2H2BE PDE4B SKT17B

36 células neurais adultas AREG é expressa na placenta
Amphiregulin ou AREG: 431 vezes menos expresso Não há redundância funcional com outros ligantes de EGFR1 Autócrina ou parácrina Membrana celular Citoplasma Fator auto-renovação células neurais adultas Diferenças in vivo e in vitro ??? Epiregulin, Neuregulin, TGF- Ligante de EGFR1 A via EGF forma uma rede muito grande de sinalização que integra várias outras vias, dependendo da ação dos diferentes ligantes sobre os receptores. A amphiregulina é um ligante de EGF que não apresentam redundancia funcional com outros ligantes dos receptores EGF, podendo agir de forma autócrina ou parácrina A AREG está altamente expressa em células malignas de tumores sólidos, nas quais estimula a proliferação Atua na regulação da proliferação e na neurogênese no cérebro adulto, sendo que é um fator mitogênico e está expressa em regiões do cérebro onde ocorre neurogenese (plexo coróide e hipocampo) Isto indica a regulação da sua expressao, sendo restrita a areas de auto-renovacao no caso de células tronco neurais. Outro dado muito interessante é a maior expressao da AREG na placenta durante a gestação, indicando que este ligante de EGFR seja importante para a regulacao das CPHs in vivo e sua regulacao negativa no cultivo que realizamos pode ser uma das causas para as diferentes propriedades das células cultivadas. AREG é expressa na placenta (gestação) 36

37 CXCR4 e homing NICHO CPH migram Células CD34+/CXCR4+ > homing
SDF-1+ NICHO CPH migram Células CD34+/CXCR4+ > homing O CXCR4 é fundamental para o homing, ou seja, para a migraçao das CPHs para a medula óssea após o transplante. A capacidade de homing das CPHs afeta diretamente a enxertia e a capacidade de reconstituição, já que as células precisam se estabelecer na medula para repopular o sistema hematopoético dos receptores. O CXCR4 é receptor do SDF-1, que é secretado pelas células da região do endósteo do nicho. As células que possuem o receptor CXCR4 migram em direçao a um gradiente de SDF-1, que lhes é quimioatrativo. As CPHs de SCU < homing do que CPHs de MO 37

38 CXCR4 e homing Ausência de estroma (SDF-1)
Razão= – 9 (microarray) Razão = -24 (qPCR) Ausência de estroma (SDF-1) HIF-1 – 4 vezes menos expresso em t3 CD26 – 10 vezes menos expresso em t3 A expressao do gene do CXCR4 foi significativamente menor nas células cultivadas em relacao as células em T0. O gene do HIF-1 que é um fator de hipóxia capaz de estimular a via CXCR4/SDF1 e esta hipo-expresso nas células cultivadas, concordante com a menor atividde da via. O CD26 ou DPP4 é outro regulador negativo da via que está 10 vezes menos expresso nas células cultivadas e tem papel fundamental na resposta migratoria das células CD34+.  Via CXCR4/SDF-1 t0 t3 p<0,0001 38

39 Células CD34+/CXCR4+ % Maior capacidade de homing t0 t3 p = 0,05 t0 t3
Aqui vemos uma análise adicional de FACS, mostrando a porcentagem de células duplamente positivas para CXCR4 e CD34. A porcentagem destas células foi significativamente menor na populacao cultivada. Portanto, como estas células duplamente positivas teriam maior capacidade de homing, isso indica que as células cultivadas possuem menor capacidade em relacoa às não-cultivadas. NO entanto, o numero absoluto destas células noa variou significativamente com o cultivo. Devemos considerar que o CXCR4 tem expressao bastate dinamica na superficie das células, inclusive sabe-se que existem estoques intracelulares de CXCR4. Portanto, mediante exposicao a um gradietne de SDF1, as células podem voltar a expressar o CXCR4 na membrana e a via pode ser reativada. p = 0,8 Expressão dinâmica do receptor CXCR4 na membrana – demora na enxertia 39

40 Genes reguladores de CPHs
Funções críticas de CPHs Auto-renovação Retenção na medula Mobilização Diferenciação Proliferação Fatores de transcrição Reguladores extrínsecos e Reguladores intrínsecos As funçoes críticas de CPHs podem ser reguladas por fatores extrínsecos (interacao com nicho) e também por fatores intrínsecos. Uma grande parte dos genes reguladores intrínsecos de CPHs são fatores de transcrição. O nível de expressão genica destes fatores é crucial para desempenho destas funções críticas pelas CPHs. 40

41 Genes reguladores de CPHs
Símbolo do Gene Razão microarray Razão qPCR HOXB4 1,3 - 1,9 SLAMF1 1,5 NA BMI-1 -3,3 FLT3 - 4,3 SCL 2,8 RUNX1 1,1 BMP4 -1,1 ZFX -1,2 TEK ou Tie2 1,2 MLL4 1,8 ABCB1 -3.7 Reguladores intrínsecos Fatores de transcrição nível de expressão Não houve grande alteração 41

42 HOXB4 : homeobox B4 Super-expressão aumenta a expansão ex vivo e in vivo Aumenta a capacidade de reconstituição Alvos não alteraram : FOXO3A, TNFRSF1B, BAMBI, SOCS2 e outros O HOXB4 foi o primeiro gene cuja super-expressão induziu a expansão ex vivo das CPHs. Ocorre aumento do desenvolvimento de células hematopoéticas a partir de embrionárias em camundongos. Há vários alvos preditos para este fator de transcrição e a expressao daqueles que foram analisados não variou nas células cultivadas As CPHs expressam menores níveis de HOXB4 à medida que se diferenciam. Nos analisamos a expressao do HOXB4. O microarray apontou uma expressao estável com razao proxima de 1. no entanto, a qPCR demosntrou que houve expressao significativamente menor no grupo de células cultivadas ou t3 em relacao ao tzero. Diferenciação  expressão de HOXB4 Células cultivadas : razão = -2 t0 t3 p=0,0002 42

43 HOXB4 : homeobox B4 Notch FGF Wnt Sinalização de citocinas
Ciclo celular Hedgehog O HOXB4 é um gene regulador de CPHs com funcao central, participando de diversas vias, como .... Apoptose/ stress Proteínas G TGF- TNF- 43

44 Bmi-1 (polycomb group family member 4)
Razão microarray = 1,5 Razão qPCR = -3,3 Depois do HOXB4, o BMI-1 é o gene mais estudado em sistemas de cultivo e expansao de CPHs. Nós verficamos uma expressao menor deste gene nas células culitvadas, emobra mais uma vez tenhamos uma grande variacao entre as amostras. t0 t3 p= 0,0005 44

45 Bmi-1 Divisões simétricas – auto-renovação intacta
Mantém células quiescentes, sem exaustão Perda da expressão de Bmi-1 correlaciona-se com a perda da capacidade de reconstituição e com apoptose O Bmi-1 regula a atividade proliferativa das CPHs e é necessário para a auto-renovação de células precursoras hematopoéticas e neurais adultas. A super-expressão do Bmi-1 aumenta a expansão, com ocorrencia de divisoes simétricas conservativas, ou seja, gerando duas células-tronco filhas identicas às células-mãe, Assim, ocorre uma grande expansao das CPHs, sem que ocorra exaustão do pool. Também aumenta a capacidade de reconstituicao das CPHs in vivo. A perda da expressao de BMI-1 COINCIDE com a perda da capacidade de reconstituição das CPHs. De fato, a expressao do BMI-1 diminuiu nas células cultivadas, indicando perda ao menos parcial da capacidade de reconstituicao destas células. 45

46 Bmi-1 Repressão da transcrição de alvos p16INK4a e p19ARF Bmi-1
 Proliferação O Bmi-1 é um repressor da transcrição Ele interage com E4F1, que por sua vez interagem com diversas ciclinas, como CDC2 e CDK2, inibindo-as. A expressao do Bmi-1 está 3 vezes menor nas células cultivadas, mas o E4F1 continua expresso, bem como alguns alvos reprimidos pelo BMI-1 como 16ink4a e p19ARF, indicando que ainda não houve  Bmi-1 ocasiona descontrole da proliferação e apoptose 46

47 Conclusões Aumento do número total de células e do número de células CD34+ Aumento médio do número de células CD34+/CD38neg e CD34+/CD90+ Não houve indução da apoptose Conservação da capacidade de diferenciação (ensaios clonogênicos) Validação da expressão dos genes analisados no microarranjo por qPCR A menor expressão de HOXB4 e Bmi-1, relacionados à perda gradativa da capacidade de auto-renovação e também associada à diferenciação 47

48 Conclusões Melhor compreensão da perda gradativa da capacidade de
Menor expressão de CXCR4 indica menor capacidade de homing e enxertia A maior expressão de genes relacionados ao ciclo celular e mitose reflete a grande atividade proliferativa das células cultivadas in vitro A maior expressão de genes relacionados à organização do fuso mitótico parece estar vinculada à alterações na polaridade celular que interferem na ocorrência de divisoes assimétricas in vitro Melhor compreensão da perda gradativa da capacidade de auto-renovação e reconstituição associada à expansão in vitro 48