Seqüência e qualidade. Seqüência e qualidade Uso da bioinformática na análise genômica.

Apresentação em tema: "Seqüência e qualidade. Seqüência e qualidade Uso da bioinformática na análise genômica."— Transcrição da apresentação:

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2 Seqüência e qualidade

3 Uso da bioinformática na análise genômica

4 iniciadores crescem até que uma unidade interruptora entre
ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTA A ATCTCGTAGCTAG G ATCTCGTAGCTAGC C ATCTCGTAGCTAGCT T ATCTCGTAGCTAGCTA A ATCTCGTAGCTAGCTAC C ATCTCGTAGCTAGCTACG G ATCTCGTAGCTAGCTACGA A ATCTCGTAGCTAGCTACGAC C ATCTCGTAGCTAGCTACGACG G ATCTCGTAGCTAGCTACGACGT T ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTC C ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCT T ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCTA A TAGAGCATCGATCGATGCTGCAGATGATGCTAGCATCGGCTAGGCGACG iniciadores crescem até que uma unidade interruptora entre uma fita molde é sequenciada de cada vez eletroforese capilar e leitura da fluorescência da unidade interruptora

5 Receber Processar Anotar Depositar
Início Bioinformática Receber Processar Anotar Depositar Fim

6 Processamento de seqüências
20 30 10 cromatograma acgatctcgctagctgctactgtagccgcgattattcgcgatctacgtatatcgcgatcgatc 10 20 30 40 50 O programa Phred lê o cromatograma e nomeia as bases Cada base tem uma chance de erro de sua nomeação (10% = 0,1) A escala de Phred é semelhante à de pH multiplicado por 10: - chance de erro de 0,001 = 10-3 = Phred 30 A nomeação é praticamente aleatória no início e no final, onde a chance de erro é alta (baixo valor de Phred)

7 I Brazilian Workshop on Bioinformatics October 18th, 2002, Gramado, RS, Brazil

8 Estratégias Genômicas

9 Crescimento do GenBank
45 milhões Seqüências 24h Europeu Japonês 606 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Ano

10 (seqüenciador grande)
Seqüencias do DNA (genoma) Seqüências do mRNA (genes expressos) Amostragem tecidos momentos Eucariotos mRNA Repetição calculada draft = 5x finished = 10x Genoma pequeno (seqüenciador grande) TR cDNA

11 Seqüenciamento parcial de transcritos

12 EST (Etiqueta de Seqüência Expressa)
Seqüênciamento de genes expressos: Documentar a existência de transcritos gênicos num transcriptoma [otorrin... e ...damonh...] EST (Etiqueta de Seqüência Expressa) seqüenciamento único de cada cDNA extremidades 5’ ou 3’ ORESTES (ESTs ricas em ORFs) seqüenciamento único do amplicon derivado de cDNA por PCR inespecífico prevalece o centro do cDNA (cds)

13 Um mRNA & suas ESTs 5’EST 3’EST 5’EST 3’EST mRNA ATG AUG cDNA (fita +)
ATCATGACTTACGGGCGCGCGAT AAATTTATTATCC (T)18 5’EST cDNA (fita -) 3’EST mRNA AUG cDNA (fita +) (A)200 (A)18 GGCGCGCGATATCC AAATTTATTATCCATCTACG (T)18 5’EST cDNA (fita -) 3’EST

14 PCR inespecífico & seu ORESTES
amplicon (fita -) amplicon (fita +) PCR (60ºC) +ORESTES (outros iniciadores) mRNA amplicon (fita +) AUG GGGCGCGCGATATCGAAAAATTTATAAGGCTAG (A)200 CCCCGGCGGCTCGGCCGGGGAGATCGATCATGAC AGATCGATCATGACTTACGGGCGCGCGATATCG ORESTES cDNA (fita -) Iniciador (60ºC ºC)

15 26,630,649 250 200 150 100

16 Bases de dados

17 O formato FASTA, o mais simples, é anotado
>Gene EST com homologia... ACTATTACGGCGTAGCTGTAGCTACGTAGCTAGCTGATGCTGACTGATCGTAGCTAGCTGACTGATCGTACGTAGTGTTTTTTTACGTGCGTATTtCTagCTaGtc Seqüências > 50 nt, sem ambiguidades e com anotação, ganham entrada no Entrez Protein/Nucleotide

18 Transcriptoma de S. mansoni Rede Genoma de Minas Gerais
dbEST: ESTs 5’ e 3’ Trace Arquive: dados originais Entrez Nucleotide: > 50 nt, em fase, com anotação Entrez Protein: proteínas deduzidas selecionadas mineração automática (KOG, BioCarta e KEGG) mineração manual (interesse de grupos) UniGene: dados de expressão diferencial (microarray e DGED) I MISS YOU

19 Anotação

20 O mundo

21 Alinhador local Identifica, numa coleção de seqüências, as que apresentam alinhamento com a sua. Fragmenta sua seqüência e procura homologia no banco de dados. Descarta todas as pesquisas com pontuação pequena (score baixo) e vai alinhando a vizinhança das com pontuação boa, até chegar ao máximo valor. É fácil verificar que algumas regiões de certos genes alinham bem, mas outras pouco conservadas, não. O Alinhador Local não quer chegar ao alinhamento final, ele só quer identificar sequências com um nível de homologia significativo

22 Alinhamento local O fundamento teórico é que a função gênica está quase sempre confinada em domínios contínuos de uma proteína Se não fosse assim, não teria sentido usar...

23 Programas BLAST & Bancos
Há vários Programas BLAST úteis Alguns são usados quando a sua sequência é de nucleotídeos (BLASTn, BLASTx e tBLASTx) Outros são usados quando a sua seqüência é de aminoácidos (BLASTp) E vários bancos de dados para escolher (nr, pdb, dbEST, yeast, month, etc...) Ou usa-se limites [organism]

24 BLASTn e BLASTx A EST identifica o gene homólogo: BLASTn
A EST identifica proteína ortóloga de outro organismo - a evolução conservou a proteína enquanto o DNA divergiu: BLASTx BLASTx: a EST traduzida em seis proteínas 1 existe, 5 não... O mundo Blast é assim

25 tBLASTx tBLASTx traduz sua seqüência de nucleotídeos para proteína nas 6 possibilidades, exatamente como BLASTx Depois pesquisa com essas 6 proteínas deduzidas, um banco de dados de nucleotídeos também traduzido dessa maneira Pra que serve? Pois imagine que a telomerase de Euplotes seja parecida com a telomerase humana, mas os dois DNA não! Traduzindo a seqüência pesquisada e o banco de dados dbEST foi possível encontrar seqüências da telomerase humana

26 bioinformática Receber Processar Anotar Depositar

27 um aglomerado = um gene

28 Aglomerados ou Clusters
Uma das atividades em bioinformática é formar aglomerados de todas as sequências geradas no projeto (as figurinhas de um álbum) Podemos saber quantas vezes um gene foi seqüenciado, e detectar os freqüentes! E quantos dos genes foram detectados Usa-se também para validar bibliotecas

29 Programas para aglomerar
Icatools Phrap Cap3, Cap4 Swat BLAST MegaBLAST Um aglomerado = Um gene

30 Qualidade das bibliotecas (100 primeiras ESTs)
Número de seqüências Boa biblioteca ? 1 2 3 4 5 7 9 11 Freqüência em que uma EST foi amostrada

31 UniGene Organização das sequências do GenBank em um conjunto de aglomerados Cada aglomerado do UniGene contém as sequências que representam um gene único E também informações relacionadas, como em que tecidos o gene é expresso, etc. E também onde está mapeado

32 MegaBLAST gera o UniGene
Todas ESTs contra todas Detecção de homologia > 96% de identidade > 70% do potencial Aglomerar

33 Construção de UniGene para AW1
(5.145 ESTs correspondem a clusters) Etapa Número de seqüências no aglomerado Número de algomerados identidade > 96 % alinhamento > 70 % do potencial

34 Outros serviços online

35 Interface gráfica Alternativa para encontrar só o gene

36 Online Mendelian Inheritance in Man
Um catálogo de genes humanos e anomalias genéticas de autoria do Dr. Victor A. McKusick e seus colaboradores e desenvolvido para a Web pelo NCBI Funciona como uma revisão já feita

37 SNP catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctaactagctgactg
catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatggtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctatctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgattgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg SNP

38 No NCBI é acessado um banco de dados: MMDB
Molecular Modelling DataBase (PDB sem teóricos) O banco de dados PDB tem um mirror no Brasil Arquivos do tipo “1MEY.pdb” são descarregados As coordenadas 3D de totos os átomos As proteínas podem ser vistas com programas (RasMol) ou direto no navegador (Plug-in Chime)

39 Modelagem Molecular por Homologia
A proteína precisa ter uma ortóloga no PDB Pode ser automaticamente modelada pelo Swiss Model (Modeller na UFMG) Já modelaram todas proteínas confira 3DCrunch:

40 Rede Genoma de Minas Gerais