NUCLÉOLO Profa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira

Apresentação em tema: "NUCLÉOLO Profa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira"— Transcrição da apresentação:

1 NUCLÉOLO Profa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira
Pós Graduanda Priscila Pasqüetto Mendonça

2 NUCLÉOLO Estrutura + facilmente visível (sem qualquer coloração): ↑ índice de refração - Descrito por Fontana (1781) e denominado por Valentin (1839)

3 Organela celular, cuja função é a de produzir ribossomos
Geralmente ovalada Ausência de membrana ao redor (sem barreira de difusão)

4 depende do estado funcional da célula
Tamanho, forma e número depende do estado funcional da célula - Tamanho - Grandes: glândulas e neurônios - Pequenos: céls da glia e endotélio Número - Normalmente 1 (linfócitos humanos) - +1: hepatócitos, céls vegetais (tulipas: 6-13) - Ovócitos de anfíbios: 3000

5 Composição Química RNA: 3-17% (pp RNAr) (RNP)
DNAr: até 17% (seqüências altamente repetidas) Proteínas: até 85% - histonas - acídicas: Numatrina, Nucleolina, Ribogranulina - enzimas: RNA polimerase I, DNA topoisomerase I e II

6 Métodos de Estudo Microscopia de Luz
Métodos citoquímicos de basofilia (AgNOR, Azul de Toluidina e Variante da Concentração Eletrolítica Crítica) Cromatina esverdeada D1, D2 - T. infestans ♂ ← D3 - T. infestans ♂ ↓ < * Nucléolo - azul

7 Métodos de Estudo Microscopia de Luz
Acridina Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado) Microscopia de contraste de fase

8 Impregnação por íons prata no cito diagnóstico do câncer
Métodos de Estudo Impregnação por íons prata no cito diagnóstico do câncer

9 Nucléolo x Citodiagnóstico
Parâmetros: Tamanho Número Forma Razão área N nu

10 Microscopia Eletrônica
Métodos de Estudo Microscopia Eletrônica - Método de Bernhard → RNA + proteínas: elétrondensos → DNA: eletronlúcidos

11 Métodos de Estudo Além de...
Análises bioquímicas e microespectrofotometria - Autorradiografia - Agentes inibidores do RNAr Análises moleculares

12 Migração das moléculas de RNAr
L Rd R n Rr Tb Ti Tv L L Ph Pm Tb Ti Tv Rd Rn Rr L A B 2.036 163 6 1018 506 Experimento realizado na região espaçadora ITS-1 Estudaram as regiões espaçadoras ITS-1 da Região Organizadora Nucleolar (RON) Migração das moléculas de RNAr Figura 1. (A) e (B) Polimorfismo de tamanho para a região ITS-1 do DNAr de triatomíneos.Os valores aproximados em pares de base são: Ph 600 pb, Pm 800 pb, Tb 850 pb, Ti 750 pb e Tv 1000 pb, Rd e Rn 300 pb, Rr 250 pb. Letra L designa os marcadores de tamanho molecular (1Kb Ladder, Gibco). Tartarotti,E & Ceron, C. R, 2002

13 Morfologia do Nucléolo
No microscópio de luz: simples - ovalada, no máximo alguns vacúolos No microscópio eletrônico: três grandes regiões Centro Fibrilar (CF) Componente Fibrilar Denso (CFD) Componente Granular (CG)

14 Morfologia do Nucléolo (MET)
Centro Fibrilar (CF) Conjunto de finas fibrilas (4-8nm) ↑ atividade transcricional, ↑ n° e tamanho dos CFs Composição Química: DNAr, DNA topoisomerase I, RNA polimerase I, RNP, Nucleolina, Numatrina, Fibrilarina Centro Fibrilar (CF)

15 Morfologia do Nucléolo (MET) Componente Fibrilar Denso (CFD)
Fibrilas densamente empacotadas → redes Ao redor dos CFs Composição Química: DNAr , RNA polimerase I, Fibrilarina, Nucleolina, Numatrina Componente Fibrilar Denso (CFD)

16 Morfologia do Nucléolo (MET) Componente Granular (CG)
Estruturas granulares de 10 a 15nm de diâmetro Periferia, ao redor do CFD Local de armazenamento das pré unidades ribossômicas Composição Química: RNP, Fibrilarina, Nucleolina, Ribogranulina Componente Granular (CG)

17 Morfologia do Nucléolo

18 Morfologia do Nucléolo (MET) Vários Centros Fibrilares
Alta transcrição

19 Morfologia do Nucléolo (MET)
4) Esqueleto Nucleolar Região amorfa relacionada com o esqueleto nuclear Composição Química: Proteínas acídicas 5) Vacúolos Nucleolares Áreas “vazias”???? Dúvidas... Artefatos??? ... Áreas menos densas???

20 Morfologia do Nucléolo (MET)
6) Cromatina associada ao Nucléolo Ao redor – envia ramificações intranucleolares Cromatina perinucleolar – não faz parte do nucléolo Segmentos cromossômicos específicos - RONs

21 EX: Triatoma infestans
Tipos de Nucléolo a) Nucléolos Reticulados (nucleolonemas) Região granular periférica + Região fibrilar central b) Compactos - Essencialmente granulosos (massa celular compacta e anastomosada) c) Em anel Camadas concêntricas: - central filamentosa - cortical granulosa EX: Triatoma infestans EX: Allium cepa EX: Anfíbios

22 Fisiologia do Nucléolo
- Biogênese dos RIBOSSOMOS - Função bem estabelecida com observações de Brown em 1964 (Xenopus laevis) - Defeito cromossômico: formação dos nucléolos (perda de DNAr) - Número de nucléolos: 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa) Aa X Aa ¼ AA: ½ Aa: ¼ aa

23 Experimento de Miller e Beatty (1967)
Ovócitos de Triturus viridescens Choque osmótico – separação das regiões nucleolares CF: filamento axial de DNA recoberto, a intervalos regulares, por RNA 45S transcrito CG: moléculas de RNA precursor da grande subunidade 32S

24 Experimento de Miller e Beatty (1967)

25 Experimento de Miller e Beatty (1967)
DNAr em tandem Muitas moléculas de RNAr transcritas Regiões de DNA espaçador “Árvore de Natal”

26 Experimento de Miller e Beatty (1967)
- Cada RNA polimerase se associa ao promotor , e se move ao longo do DNAr

27 Metabolismo Nucleolar
RON: motivo genético altamente redundante DNA Espaçador; ITS: Segmentos intercalares transcritos; ETS: Seqüência externa transcrita

28 Metabolismo Nucleolar

29 Metabolismo Nucleolar
Subunidade maior (60S): RNAr 28S + RNAr 5,8S + RNAr 5S + proteínas nucleolares Subunidade menor (40S): RNAr 18S + proteínas nucleolares Proteínas nuleolares: Importadas do citoplasma S = Unidade de Sweedberg – é a unidade que se utiliza na medida da velocidade com a qual se sedimentam as partículas no campo de centrifugação. Ocorre influência do tamanho, densidade e forma da partícula e também do meio no qual as partículas estão suspensas.

30 Metabolismo Nucleolar
Processamento do RNA: RNA 45 S RNA 32 S RNA 20 S RNA 28 S RNA 18 S + RNA 5,8 S Subunidade menor + RNA 5 S Subunidade maior

31 Metabolismo Nucleolar
As proteínas nucleolares (ou ribossomais) são importadas para o nucléolo a partir do citoplasma e começam a unir-se ao pré-RNAr (RNA 45 S) antes de sua clivagem. Enquanto o pré-RNAr é processado, proteínas nucleolares adicionais e o RNAr 5 S (transcrito de uma outra região que não pertence à RON) unem-se para formar partículas pré-ribossomais. Os passos finais da maturação seguem a exportação de partículas pré-ribossomais para o citoplasma, produzindo as subunidades ribossomais 40 S e 60 S

32 Regiões Organizadoras Nucleolares (RONs)
Moldes de DNA relacionados com a síntese de estruturas nucleolares – zonas de constricções secundárias que apresentam regiões satélites RONs: local do cromossomo responsável pela codificação do RNA 45S

33 Representação esquemática da metade do cariótipo
Cromossomos Humanos - zonas de constricções secundárias (ativamente transcritos) - regiões satélites Representação esquemática da metade do cariótipo

34 Biogênese do Nucléolo Como o nucléolo se organiza??!!
Presente durante intérfase e início da prófase “Desaparece”: final da prófase (mitose) e no diplóteno (meiose) “Reaparece” na telófase

35 Dez pontinhos, representando os dez cromossomos portadores das RONs
Biogênese do Nucléolo No Homem: após a mitose, dez pequenos nucléolos são formados, que rapidamente se fundem, formando um único e grande nucléolo A aparência do nucléolo muda dramaticamente durante as diferentes fases do ciclo celular Dez pontinhos, representando os dez cromossomos portadores das RONs

36 Biogênese do Nucléolo Três hipóteses:
Reconstrução do nucléolo a partir dos corpúsculos pré-nucleolares que estão agrupados junto as RONs 2) Reconstrução a partir de uma Matriz pré-existente 3) Formação de estrutura totalmente nova a partir da RON

37 OBRIGADA!