Extensive Association of Functionally and Cytotopically Related mRNAs with Puf Family RNA-Binding Proteins in Yeast André P. Gerber, Daniel Herschlag,

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1 Extensive Association of Functionally and Cytotopically Related mRNAs with Puf Family RNA-Binding Proteins in Yeast André P. Gerber, Daniel Herschlag, Patrick O .Brow Plos Biology - March 2004

2 Introdução Dinâmica celular: síntese e localização das macromoléculas
Fatores de transcrição: regulam o início da transcrição ao se ligar a seqüências de DNA próximas aos genes que serão regulados E a regulação Pós -transcrição?

3 RNA-binding proteins - RPBs participam dos processos pós transcrição .
Há centenas de RPBs em genomas de eucariotos; mas poucos possuem o RNA alvo identificado.

4 Pumilio -Fem-3-binding factor (Puf) : RPB citoplasmática de Saccharomyces cerevisae
Puf: proteínas que apresentam seqüências repetitivas de domínios Pumilio Saccharomyces cerevisae : 5 proteínas Puf. Puf1 a Puf5 que podem apresentar de 6 a 8 seqüências repetitivas.

5 Identificação de mRNAs associados com RBPs específicas
As proteinas A-tagged Puf foram capturadas com Ig-G Sepharos e separadas por clivagem com TEV protease Os RNAs associados à proteinas foram isolados Duas amostras foram utilizadas na análise: RNA total e RNA isolado por afinidade ao PUF e foi preparado o cDNA Cópias c DNA foram titulados por fluorescência e DNA microarrays de levedura

6 Figura 1

7 Seleção dos alvos das PUFs :
Seleção das seqüências enriquecidas com fatores correspondentes aos isolados por afinidade que estavam pelo menos a dois desvios padrões acima da outras seqüências. Diferentes mRNA = diferentes Pufs A identificação das PUFs e seus alvos confirmaram as funções das interações RNA - proteina A lista de RNAs alvos também não foi alterada após análise estatística

8 Definição dos RNAs alvos das PUFs

9 Em S. cerevisiae : apenas 2 mRNA foram identificados para as proteínas PUF.
Puf3 : COX mRNA 3’-UTR (in vitro) Puf5p : regulam negativamente a expressão de genes repórteres, substituindo o HO de endonucleases

10 Alterações nos genes PUFs de Saccharomyces cerevisiae
PUF4 e PUF5: diminuição da longevidade, PUF1: supressor de mutação em microtúbulos PUF2 null: aumento de resistência a cycloheximide e paramomycin PUFs ausentes: células viáveis

11 18 % dos genes codificam proteínas associadas à membrana em Sc
Puf1p e Puf2p 18 % dos genes codificam proteínas associadas à membrana em Sc A maior parte dos Pufps 1 e 2 associam- se a mRNAs para proteínas associadas à membrana Proteínas associadas à membrana: funções de transporte transmembrana e transporte vesicular de protínas.

12 Puf3p Puf1p e Puf2p Está associado à produtos gênicos mitocondrias. 80% biossíntese de proteínas que apresenta função estruturais em ribossomos. Entre 22 Pufps associadas a mRNAs transcritos de mitocondrias ; 17 estão envolvidos na respiração e 12 na translocação mitocondrial.

13 Puf4p Associa-se a mRNA envolvidos na síntese , processamento e maturação dos ribossomos - nucléolo

14 Puf5p Puf5p : Liga-se a frações de mRNA que codificam proteínas que participam da modificação covalente de histonas. Puf5p: Liga-se a frações que codificam proteínas envolvidas na regulação da mitose.

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17 Conclusões A ligação das RBPs ( Pufp) a mRNA permite maior flexibilidade regulatória que o operon. As RBPs demonstraram a possibilidade de se regular especificamente o local, a tradução e a sobrevivência do RNAm. Muitos dos RNAs que ligam -se a RBPs codificam proteínas que são ativas em locais celulares específicos, que formam complexos e participam de vias celulares.

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