Descoberta de novas drogas, Estudos em patologia, - Diagnóstico,

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1 Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica
Descoberta de novas drogas, Estudos em patologia, - Diagnóstico, Terapias, Microbiologia, Bioquímica, Fisiologia de plantas, Controle de qualidade.

2 Abordagens em Proteômica
Proteômica de Expressão Expressão Diferencial Proteômica Funcional Interação Proteina-Proteina Vias de Sinalização Modificação Pós- traducional Proteômica Quantitativa

3 LABORATORIOS. ASSOCIADOS AGROBIOLOGIA-EMBRAPA
REDE PROTEÔMICA DO RIO DE JANEIRO CONFIGURAÇÃO ATUAL - 2D LT FIOCRUZ MALDI TOF -IBf DBqMED 2D UFRJ MALDI TOF-TOF IOC Caracterização de proteínas LQPP 2D UENF Q-TOF - UENF UMG 2D IBf - UFRJ Q-TOF - IBqM LABIOS 2D IQ - UFRJ Os produtos obtidos da análise por gel-2D que necessitem de identificação por espectrometria de massa são analisadas nas UFIPs dotadas de MALDI-TOF. As proteínas que não forem identificadas por este método, serão sequenciadas através da técnica ESI Q-TOF. As proteínas identificadas que apresentem interesse particular, quando factível, terão suas estruturas determinadas pela Unidade de Apoio em Genômica Estrutural. LBFP UERJ 2D LABORATORIOS. ASSOCIADOS RMN ESPEC MASSA – PUC AGROBIOLOGIA-EMBRAPA BIOQ UERJ 2D - 2D GEN UFRJ BIOINFORMATICA INCa

4 Penha, C. V. L., Bouchara, J. F., Lopes-Bezerra, L. M.
Análise proteômica comparativa de diferentes extratos proteicos isolados de cepas mutantes e selvagem de C. glabrata Penha, C. V. L., Bouchara, J. F., Lopes-Bezerra, L. M.

5 Candida glabrata Maior obstáculo nas infecções por C. glabrata
resistência adquirida a terapias por azólicos Espécies mais comuns causadoras da candidíase invasiva Espécies Frequência Candida albicans 50% Candida tropicalis % Candida glabrata % Candida parapsilosis % Candida krusei ~1% Candida lusitaniae ~1%

6 Potenciais mecanismos moleculares de resistência aos antifúngicos
Alterações no processamento intracelular do antifúngico Modificação Degradação Alterações da enzima alvo Mutação pontual Superexpressão Amplificação gênica Conversão gênica ou recombinação mitótica Alterações de outras enzimas na via da biossíntese do ergosterol Bombas de efluxo Transportadores ABC “Major” Facilitadores

7 Objetivo Contribuir para o entendimento das prováveis modificações envolvidas nas respostas adaptativas dos fungos frente aos medicamentos antifúngicos Cepa 1085 S = selvagem Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos

8 Candida glabrata Proteínas Parede celular Citoplasma Microssoma
Cepa 1085 S = selvagem Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos Proteínas Parede celular Citoplasma Microssoma

9 “ ’’ Candida glabrata Cepa 1085 s = selvagem Culturas
Cepa 178 = mutante PMSF EDTA Pepstatina RNAse “ ’’ Bilhas de vidro braun

10 Centrifugação: 2’ 500 g  eliminação das bilhas de vidro
5’ 1000 g  pellet - C1 = parede 30’ g  pellet - C2 = mitocôndria 60’ g  pellet - C3 = microssoma Sobrenadante = proteínas do citosol C4

11 “ ’’  Solubilização de proteínas C1 C3 C2
“ ’’ Sonificação - 3 ciclos de 15’  Chaps  Uréia  DTT on Dosagem de Proteínas = Bradford C1, C3 e C4

12 Eletroforese Bidimensional
(Strip 18 cm -Gel 12%) A) 1085-S B) 1085-BET Mr (kDa) 250 150 100 37 25  Mr (kDa) 250 150 100 37 25   IEF  IEF  SDS  SDS 3, ,0 pI 3, ,0 pI

13 Two-dye overlay (1085-S/1085-BET)
Spots 1085-S BET Matching Spots 187 110 168 1085-S = azul 1085-BET= vermelho

14 Identificação por MALDI TOF/TOF
3, IEF ,0 Piruvato decarboxilase Fosfohexose isomerase Enolase Frutose 1,6 bifosfato aldolase Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 61 58 18 19 20 21 22 23 24 62 29 28 27 26 25 32 33 31 30 59 60 57 63 34 35 36 37 56 41 42 40 39 38 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

15 In collaboration with the Department of Cellular Biology and Genetics
“Expressão diferencial de proteínas da parede celular de leveduras e conídios do fungo dimórfico Sporothrix schenkii” In collaboration with the Department of Cellular Biology and Genetics UERJ

16 PREMISES GOALS etiological agent of feline and human sporotrichosis
most common Latin America mycosis can affect tissues and internal organs dangerous to immunosupressed individuals morphological transition is a key factor in virulence GOALS - understand the physiopathology of disseminated sporotrichosis - identify virulence factors/ molecular biomarkers

17 2D-PAGE dos CWPs obtidos da parede celular de diferentes formas do S
2D-PAGE dos CWPs obtidos da parede celular de diferentes formas do S. schenckii 3, IPG ,0 3, IPG ,0

18 foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradiente
Morfologia n de spots Percentual de prote í nas por faixa de pH a pI 3,0 – 5,0 7,0 10,0 Levedura 233 18,4% ,0% 23,6% Con dio 112 29,5% 54,5% 16,0% Tabela 1 - Quantificação das proteínas expressas ( spots ) na parede celular da forma de levedura e de conídios nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivo s pontos isoelétricos. foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradiente de pH de 3,0 a 10,0.

19 Two-dye overlay (Levedura/Conídio)
4, IPG ,0 A SDS B N N de de Spots Spots Lev Con Lev Con 141 141 32 32 32 32 Interseção levedura - azul conídio - vermelho

20 O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?

21 O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?
SÓ ISSO?!

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25 Uma visão para o futuro.... produtos metabólicos
fragmentos gerados enzimáticamente

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27 SELDI - Surface Enhanced Laser Desorption Ionization

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29 Geração sistemática de anticorpos monoespecíficos para explorar o proteoma humano.
- Análise de padrões de expressão protéica e localização subcelular; - Investigação de vias de interação; - Variantes resultantes de splicing; - Modificações pós-traducionais.

30 > 400 genes humanos aa consecutivos

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33 PERSPECTIVAS Conjunto de proteínas humanas não-redundantes (proteína representativa por locus genético) estimado em 20 a 25 mil; Produção de milhares de msAb possível por ano com essa nova técnica; Previsão para completar o projeto em alguns anos.

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