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Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica Aplicações: - Descoberta de novas drogas, - Estudos em patologia, - Diagnóstico,

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1 Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica Aplicações: - Descoberta de novas drogas, - Estudos em patologia, - Diagnóstico, - Terapias, - Microbiologia, - Bioquímica, - Fisiologia de plantas, - Controle de qualidade.

2 Abordagens em Proteômica Proteômica de ExpressãoProteômica de Expressão –Expressão Diferencial Proteômica FuncionalProteômica Funcional –Interação Proteina-Proteina –Vias de Sinalização –Modificação Pós- traducional Proteômica QuantitativaProteômica Quantitativa

3 - Caracterização de proteínas BIOINFORMATICA LABIOS IQ-UFRJ UMG IBf-UFRJ LQPP UENF DBqMED UFRJ LT FIOCRUZ 2D - REDE PROTEÔMICA DO RIO DE JANEIRO CONFIGURAÇÃO ATUAL LBFP UERJ BIOQ UERJ 2D GEN UFRJ 2D Q-TOF - IBqM MALDI TOF -IBf Q-TOF - UENF LABORATORIOS. ASSOCIADOS RMN ESPEC MASSA – PUC AGROBIOLOGIA-EMBRAPA INCa MALDI TOF-TOF IOC

4 Análise proteômica comparativa de diferentes extratos proteicos isolados de cepas mutantes e selvagem de C. glabrata Penha, C. V. L., Bouchara, J. F., Lopes-Bezerra, L. M.

5 Candida glabrata Maior obstáculo nas infecções por C. glabrata resistência adquirida a terapias por azólicos Espécies mais comuns causadoras da candidíase invasiva Espécies Frequência Candida albicans50% Candida tropicalis15-30% Candida glabrata15-30% Candida parapsilosis 15-30% Candida krusei~1% Candida lusitaniae ~1%

6 Potenciais mecanismos moleculares de resistência aos antifúngicos Alterações no processamento intracelular do antifúngico Modificação Degradação Alterações da enzima alvo Mutação pontual Superexpressão Amplificação gênica Conversão gênica ou recombinação mitótica Alterações de outras enzimas na via da biossíntese do ergosterol Bombas de efluxo Transportadores ABC Major Facilitadores

7 Objetivo Contribuir para o entendimento das prováveis modificações envolvidas nas respostas adaptativas dos fungos frente aos medicamentos antifúngicos Cepa 1085 S = selvagem Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos

8 Candida glabrata Parede celular Microssoma Citoplasma Proteínas Cepa 1085 S = selvagem Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos

9 Culturas Cepa 1085 s = selvagem Cepa 178 = mutante PMSF EDTA Pepstatina RNAse Candida glabrata braun Bilhas de vidro

10 Centrifugação: g eliminação das bilhas de vidro g pellet - C 1 = parede g pellet - C 2 = mitocôndria g pellet - C 3 = microssoma Sobrenadante = proteínas do citosol C 4

11 Solubilização de proteínas C1 C3 on Sonificação - 3 ciclos de 15 Chaps Uréia DTT Dosagem de Proteínas = Bradford C1, C3 e C4 C2

12 (Strip 18 cm -Gel 12%) A) 1085-S IEF SDS 3,0 11,0 pI Mr (kDa) B) 1085-BET SDS IEF 3,0 11,0 pI Mr (kDa) Eletroforese Bidimensional

13 Spots 1085-S 1085-BET Matching Spots Two-dye overlay (1085-S/1085-BET) 1085-S = azul 1085-BET= vermelho

14 Identificação por MALDI TOF/TOF Piruvato decarboxilase Fosfohexose isomerase Enolase Frutose 1,6 bifosfato aldolase Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase 3,0 IEF 11,0

15 Expressão diferencial de proteínas da parede celular de leveduras e conídios do fungo dimórfico Sporothrix schenkii In collaboration with the Department of Cellular Biology and Genetics UERJ

16 - etiological agent of feline and human sporotrichosis - most common Latin America mycosis - can affect tissues and internal organs - dangerous to immunosupressed individuals - morphological transition is a key factor in virulence GOALS - understand the physiopathology of disseminated sporotrichosis - identify virulence factors/ molecular biomarkers PREMISES

17 2D-PAGE dos CWPs obtidos da parede celular de diferentes formas do S. schenckii 3,0 IPG 10,0

18 Morfologian de spotsPercentual de proteínas por faixa de pH a pI3,0–5,0pI5,0–7,0pI7,0–10,0 Levedura23318,4% 58,0%23,6% Conídio11229,5%54,5%16,0% Tabela 1-Quantificação das proteínas expressas (spots) na parede celular da forma de levedura e de conídios nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivos pontos isoelétricos. a-foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradientede pH de 3,0 a 10,0. Morfologian de spotsPercentual de proteínas por faixa de pH a pI3,0–5,0pI5,0–7,0pI7,0–10,0 Levedura23318,4% 58,0%23,6% Conídio11229,5%54,5%16,0% Tabela 1-Quantificação das proteínas expressas (spots) na parede celular da forma de levedura e de conídios nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivos pontos isoelétricos. a-foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradientede pH de 3,0 a 10,0.

19 14132 N de Spots Lev Con N de Spots Lev Con A B Interseção 4,0 IPG 7,0 SDS Two-dye overlay (Levedura/Conídio) levedura - azul conídio - vermelho

20 O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?

21 SÓ ISSO?!

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25 Uma visão para o futuro.... produtos metabólicos fragmentos gerados enzimáticamente

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27 SELDI - Surface Enhanced Laser Desorption Ionization

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29 Geração sistemática de anticorpos monoespecíficos para explorar o proteoma humano. - Análise de padrões de expressão protéica e localização subcelular; - Investigação de vias de interação; - Variantes resultantes de splicing; - Modificações pós-traducionais.

30 > 400 genes humanos aa consecutivos

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33 PERSPECTIVAS Conjunto de proteínas humanas não-redundantes (proteína representativa por locus genético) estimado em 20 a 25 mil; Produção de milhares de msAb possível por ano com essa nova técnica; Previsão para completar o projeto em alguns anos.

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