د. عمر عبد القادر.

Apresentação em tema: "د. عمر عبد القادر."— Transcrição da apresentação:

1 د. عمر عبد القادر

2 التثبيت والطمر للمجهر الإكتروني
(الفصل التاسع ) التثبيت خطوات التثبيت أهم المثبتات المحاليل المنظمة التجفيف والطمر أنواع مواد الطمر د. عمر عبد القادر

3 أولا التثبيت Fixation الغرض من التثبيت هو حفظ التفاصيل التركيبية الخلوية للعينة في حالة مشابهة لما كانت علية قبل فصل العينية من الكائن الحي . تحويل المواد البروتينية الذائبة إلى مواد متخثرة مما يحد من عملية التحلل الذاتي و البكتيري مع المحافظة على طبيعة العضيات الخلوية واكساب العينة قدرا من الصلابة تمكنها من تحمل عمليات التجفيف والطمر التي تعقب عملية التثبيت . خطوات التثبيت : الحصول على العينة :عدم ازعاج الكائن الحي حتى لا يختل النظام الإفرازي / يفضل عدم استخدام المواد المخدرة لقتل الحيوان لما تسببه من تغيرات داخلية مع سرعة وضع العينة بالمثبت لكي لا تتحل بعض الموكونات الخلوية / والحشرات والطفيليات تشرح في محلول المثبت مباشرة د. عمر عبد القادر

4 نفاذية المثبت: يجب أن يتميز المثبت بسرعة نفاذة لمكونات العينية /
تابع خطوات التثبيت : نفاذية المثبت: يجب أن يتميز المثبت بسرعة نفاذة لمكونات العينية / أن تقطع العينة إلى مكعبات صغيرة (2مم) لتسهل سرعة نفاذ المثبت الضغط الأسموزي والرقم الهيدروجيني للمثبت: يجب أن يكون الضغظ الأسموزي للمثبت مشابها للضغط الأسموزي للعينية أن يحتوى على محلول متعادل (Isotonic solution ) كذلك الإختلال في الأس الهيدروجيني ربما يحرر أيوانات الهيدروجين لذا يفضل إضافة احد المحاليل المنظمة (Buffer) درجة حرارة التثبيت ومدة التثبيت : كلما زادت درجة الحرارة كان سرعة التثبيت اكبر والتثبت لمدة طويلة عند درجة حرارة عالية يسبب فصل بعض مكونات الخلية . مدة التثبيت تعتمد على نوع المثبت وحجم ونوع العينة (1-4 ساعات) تركيز المثبت: تعتمد على نوع المثبت كلما كان تركيز المثبت قليل احتاج لمدة أطول للتثبيت وإذا كان التركيز عالي جدا قد يكسر عضيات الخلية د. عمر عبد القادر

5 أهم المثبتات للمجهر الإلكتروني
1- رابع أكسيد الأوزميوم (Osmium Tetroxide Os O4) يتفاعل مع الروابط الثنائية في الدهون ويعمل على ربط الجزيئات المتجاورة مع بعضها البعض: O رابع أكسيد الأوزميوم الدهون CH CH-O O-CH Os O Os OsO3 CH CH-O O-CH جزئ دهون أوزميوم جزئ دهون -كما يعتقد بانه يعمل روابط مع البروتينات المجاميع الكبريتية الفعالة فيها (SH, SS) بينما لا يتفاعل رابع أكسيد الأوزميوم مع الحموض النووية والمواد السكرية (انظر الشكل 9-1أ،2أ.) رابع أكسيد الأوزميوم سريع التطاير(Volatile)وأبخرتة شديدة السمية تقتل الخلايا الطلائية - يحفظ في حاويات داكنة او تغلف بالقصدير . د. عمر عبد القادر

6 المثبتات التي تحتوى على الألدهيدات Fixatives containing Aldehyde
محلول الفورمالدهيد هو احد المثبتات شائعة الإستخدام في مجال المجهر الضوئي و لكنة غير مرغوب بة بالنسبة للمجهر الإلكتروني. لكن محلول الجلوتر ألدهيد يحبذ كمثبت ثاني مع رابع أكسيد الأوزميوم الجلوتر ألدهيد مركب عضوي يتكون من سلسلة من خمس ذرات كربون تحمل مجموعتي ألدهيد وزنة الجزيئي 100,12 ويمتاز بلزوجة منخفضة ، وضغطة البخاري 17مم زئبق عند درجة 20مْ. ويعتبر قليل السمية نسبيا ويحضر على هيئة محلول تركيزه 25% قليل الثبات عند درجة حرارة الغرفة لذا يحفظ بالثلاجة . ويعمل على تثبيت البروتينات في العينات ومدة التثبيت ساعة ،وهو اقل تطايرا O O C-CH2- CH2- CH2-C H H د. عمر عبد القادر

7 ا د. عمر عبد القادر

8 التثبيت المضاعف Double Fixation
حاليا لا يستخدم رابع اكسيد الأوزميوم كمثبت لوحدة لعينات المجهر الألكتروني بل يستخدم معه مثبت اخر لذلك تعتبر عملية التثبيت مضاعفة حيث يستخدم مثبتين الأول الأوزميوم والثاني الجلوترألدهيد فالأول يثبت الدهون المتعادلة والفسفورية بينما الجلوترألدهيد يثبت البروتينات للخلية مثبت البرمنجنات(البوتاسيوم) كانت تستخدم لتثبيت العينات النباتية فهي مادة تؤكسد تشبه رابع اكسيد الأزميوم لكنها تؤثر على الأنسجة بشكل مختلف وتعمل على تحطيم الحمض النووى الريبوزي والهستونات ،كما انها تذيب بعض البروتينات ،وتتاثر العينات المثبته بالبرمنجنات بالكحولات عند نزع الماء فيما بعد. حاليا استبدلت بمثبتي الأوزميوم والجلوترألدهيد. د. عمر عبد القادر

9 د. عمر عبد القادر

10 د. عمر عبد القادر

11 المحاليل المنظمة المستخدمة في المجهر الإلكترونيBuffers For EM
المحاليل المنظمة هي التي تمتزج مع المثبتات للمجهر الإلكتروني وتشمل : أ- محلول خلات الفيرونال المنظم :Veronal Acetate Buffer استعمل هذا المنظم مع بداية استخدام المجهر الإلكتروني (العالم بالاد 1952م) يستخدم مع رابع أكسيد الأوزميوم ولا يستخدم مع الألدهيدات نظرا لتفاعله معه. ب- منظمات فوسفاتية : Phosphate Buffers شائع الإستعمال لكلا المثبتات رابع أكسيد الأوزميوم و الألدهيدات ويعرف بالحلول الفسيولوجي نظرا لوجوده في الأعضاء الحية ،وليس له تأثير سمي يمتاز بأن قوته التعددية عند الأس الهيدروجيني7.4 Ph 7.4 من أمثلته محلول ميولنج الفوسفاتي المنظم (Millonig’s phosphate buffer) مناسب بسبب قلة تأثيره على البروتينات وغيرها من المكونات الخلوية منظم الفوسفات يترسب بسرعة ولا يفضل مع المثبتات التي تحتوى على الكاتيونات ثنائية الشحنة مثل (Ca2+) وكذلك لا يستعمل مع كشوف كيمياء الأنسجة التي يستخدم فيها الرصاص. د. عمر عبد القادر

12 د. عمر عبد القادر

13 تابع المحاليل المنظمة المستخدمة في المجهر الإلكترونيBuffers For EM
ج- منظم الكاكوديلات Cacodylate Buffer لقد استعمل سباتيني وزملاؤه محلول الكاكوديلات الصوديوم المنظم منذ 1963م كمحلول منظم لمثبت الجلوترألدهيد ، لكن هذا المحلول يتأثر بكل من رابع أكسيد الأوزميوم والألدهيد ، ومع هذا يعتبر أفضل من محلول الفوسفات المنظم .ويناسب أنسجة معينة . محتويات المنظم الزرنيخية تقلل من تلف البكتيريا ولكن تجعل المحلول ذا سمية عالية. د. عمر عبد القادر

14 ثانيا: التجفيف والطمر للمجهر الإلكتروني Dehydration and Embeding for EM
للحصول على قطاعات رقيقة جدا للمجهر الإلكتروني لابد أن تتخلل مواد الطمر إلى داخل النسيج ،ومواد الطمر لا تمتزج مع الماء لذا لابد من نزع الماء من العينات ويستخدم الأسيتون او الكحول الأيثليى لنزع الماء من العينات . ولان الكحول مذيب للدهون لابد من سرعة تمرير العينات فيه بسرعة تمرر العينات بعد التثبيت في تراكيز تصاعدية متدرجة من الكحولات ( %) ولمدة 10 دقيقة لكل تغيير إذا كانت مادة الطمر تمتزج مع الكحول لا مانع من نقلها إليها و إن كانت لا تمتزج فإنها تنقل الى مادة الأبوكسي بروبان للتخليل (Epoxypropane) ولمدة نصف ساعة . ثم تنقل العينات إلى مزيج 1:1من مادة الأبوكسي بروبان ومادة الطمر الراتنج (Resin) 4-6ساعات بعدها تنقل إلى مادة راتنج نقية ويترك ليلة كاملة على جهاز التحريك. ثم تنقل العينات الى الكبسولات التي سوف تطمر بها ويصب عليها مادة الطمر الراتنج. تنقل العينات المطمورة الى الفرن 40مْ لمدة 24 ساعة حتى تتبلمر الراتنج او تتصلب د. عمر عبد القادر

15 جهاز التحريك للعينات د. عمر عبد القادر

16 أنواع مواد الطمرType of Embedding Media
تستخدم مواد الطمر للمجهر الإلكتروني بحيث يمكن تقطيعها إلى قطاعات رقيقة جدا (100نانومتر (0.1ميكرون) والتي لا تتوفر في مواد الطمر العادية للمجهر الضوئي مواد الطمر للمجهر الإلكتروني تشمل : 1-مادة الميثا أكرليت :Methaacrylate من أولى المواد التي استخدمت للطمر للمجهر الإلكتروني ، تعمل على انكماش النسيج ، وكثرة الفقاعات الهوائية المتكونه حول العينة المطمورة، كما أن القطاعات يحصل لها تكسر نتيجة لتأثرها بالحرارة عند فحصها بالمجهر الإلكتروني. 2-راتنجات الأبوكسي Epoxy Resin لقد وصف جلاارت((Glauert 1958م مادة الأرالديت (Araldite) كمادة طمر . ثم وصف كل من كوشيدا 1959 وفينك 1960 مادة الأيبون كماد مناسبة للطمر فأصبح الأرالديت والأيبون هما مادتي الطمر الروتينية في عمليات المجهر الإلكتروني. كما وصف العالم سبر 1969م راتنجات سبر يتميز بلزوجة منخفضة وسرعة نفاذ عالية لكنة سريع التطاير وسام جدا . 3- راتنجات عديد الاستر :Polyester Resins تماثل الرتنجات الأبوكسي لكنها صعبة التقطيع وبعض مكوناتها قصيرة العمر د. عمر عبد القادر

17 4- مواد الطمر القابلة للذوبان في الماء : water-soluble embedding Media
توفر مواد الطمر القابلة للذوبان في الماء الوقت حيث لا تحتاج لنزع الماء . وتتم عمليات التجفيف بكفاءة عالية عند غمس العينات في تراكيز متزايده من مادة الطمر . كما تمتاز مواد الطمر بسهولة صبغ النسيج من مواد الطمر القابلة للذوبان بالماء مادة الأكون (Aquon) والدوركوبان (Durcupan) وميثا اكريلات الجليكول (Glycol methacrylate) ، وكذلك ميتا اكريلات هيدروكيسي البروبيل (Hydroxy propyl methacrylate) لكن تعتبر الميثا كريلات من أنسب تلك المواد استعمالا. د. عمر عبد القادر