REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APOPTOSE NO TECIDO LAMINAR DO CASCO DE EQÜINOS COM AFECÇÕES GASTRINTESTINAIS NATURAIS E EXPERIMENTALMENTE INDUZIDAS Luciane M. Laskoski¹a, Carlos A. A. Valadão², Rosemere O. Vasconcelos², Renee L. Amorim³, Adriana H. Souza4, Renata G. S. Dória¹ 1. Universidade de Cuiabá, Faculdade de Medicina Veterinária – Cuiabá, MT 2. Universidade Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Jaboticabal, SP 3. Universidade Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Botucatu, SP 4. Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina – Ribeirão Preto, SP a Email: lucianelaskoski@hotmail.com Palavras-chaves: eqüinos, laminite, apoptose, síndrome cólica INTRODUÇÃO Os distúrbios gastrintestinais tratados na medicina eqüina comumente levam ao desenvolvimento de lesões laminares do casco, as quais podem efetivamente comprometer a vida e função locomotora dos eqüinos. Evidências experimentais apontam a ocorrência de apoptose, em condições normais nas lâminas dérmicas e epidérmicas, e estando aumentada após o aparecimento dos sinais clínicos da laminite (FALEIROS et al., 2004, SOUZA, 2007). A morte celular não seguida de autólise ou apoptose acontece pela ativação de proteases, chamadas caspases, que são encontradas sob a forma de pró-enzimas no citosol celular (HOTCHKISS & NICHOLSON, 2006), causando destruição do DNA, por ativação de DNAase no núcleo celular, e desorganização da estrutura normal do citoesqueleto da célula (NICHOLSON, 1999; CREAGH et al., 2003; BOCCELLINO et al., 2004). MATERIAL E MÉTODOS Foram avaliados quanto a morfologia e contagem de células apoptóticas, tecido laminar do casco de eqüinos pertencentes a três grupos: grupo controle (Gc), contendo sete animais normais oriundos de abatedouro comercial; grupo síndrome cólica (Gsc), contendo cinco animais com síndrome cólica naturalmente adquirida, atendidos no Hospital Veterinário da UNESP – Jaboticabal e que vieram a óbito; e grupo obstrução jejunal experimental (Goe), contendo nove eqüinos submetidos a obstrução jejunal por balão de látex distendido no lúmen intestinal por quatro horas, sendo submetidos a eutanásia após 18 horas de reperfusão intestinal. Apenas um animal, do grupo Gsc apresentou claudicação. A remoção do tecido laminar seguiu o método descrito por Pollitt (1996). Foram feitos cortes do tecido em parafina em lâminas coradas por H&E e PAS para observação morfológica por microscopia óptica, e lâminas para pesquisa de células apoptóticas por imunoistoquímica. As alterações morfológicas foram classificadas em escore, variando de 0 a 3 com escalas intermediárias, e a contagem de células apoptóticas imunomarcadas foi feita por área do corte tecidual na lâmina observada. FIGURA 1 - Fotomicrografias da lâmina do casco de eqüinos. (A) Escore 0,5, nota-se a presenca de núcleos de células basais (CB) ovalados (↓) e lâminas epidérmicas secundárias (LES) de extremidade arredondada (inferiores), mas também a presença de núcleos de CB esféricos (→) e afilamento de algumas LES (superiores) (GOE, Hematoxilina e Eosina, obj. 40x). (B) Escore 0,5, apresentando membrana basal (MB) de contorno definido (seta) (GC, PAS, obj. 40x). (C) Escore 3, nota-se intensa destruição da arquitetura lamelar, com LES descoladas da lâmina epidérmica primária (LEP, setas), e formando massa amorfa. Presença de congestão acentuada (GSC, Hematoxilina e Eosina, obj. 40x). (D) Escore 3, com ausência de MB (setas) em alguns segmentos e contorno acentuadamente irregular (GSC, PAS, obj. 40x). (E e F) Imunomarcação positiva para caspase 3, determinando presence de apoptose (LSAB kit, cromógeno DAB) CONCLUSÃO Os distúrbios gastrintestinais, de origem natural ou induzida, conduzem a alterações da morfologia laminar do casco, podendo ser clinicamente imperceptíveis dependendo do grau da lesão; a apoptose não parece estar associada à fase de desenvolvimento da laminite, uma vez que não foi possível estabelecer correlação de alterações morfológicas com aumento de células apoptóticas no tecido laminar dos animais deste estudo. RESULTADOS Os animais dos grupos Gsc e Goe apresentaram alterações morfológicas superiores aos animais do Gc pelo método estatístico de Kruskal Wallis, sendo elas: células basais (CB) com núcleos arredondados, afilamento da extremidade da lâmina epidérmica secundária (LES), separação entre LES pouco distinta, com redução da lâmina dérmica secundária (LDS) entre elas, lâmina epidérmica primária (LEP) com extremidade afilada, e apresentando ondulações no seu eixo queratinizado, contorno da membrana basal (MB) indefinido, apresentando aspecto serrilhado e borrado em alguns segmento. Não houve diferenças entre estes dois grupos, apenas em relação ao grupo controle. Em relação a pesquisa de apoptose, todos os grupos apresentaram marcação positiva na imunoistoquímica, obtendo núcleo das células basais imonomarcados, não havendo diferença entre eles. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BOCCELLINO, M., GIUBERT G., QUAGLIUOLO, L.; MARRA, M.; D'ALESSANDRO, A. M.; FUJITA, H.; GIOVANE, A.; ABBRUZZESE, A.; CARAGLIA, M. Apoptosis induced by interferon-alpha and antagonized by EGF is regulated by caspase-3-mediated cleavage of gelsolin in human epidermoid cancer cells. Cell Physiology, v. 201, n. 1, p. 71-83, 2004. CREAGH, E. M.; CONROY, H.; MARTIN, S. J. Caspase-activation pathways in apoptosis and immunity. Immunological Reviews, v. 193, p. 10–21, 2003. FALEIROS, R. R.; STOKES, A. M.; EADES, S. C.; KIM, D. Y.; PAULSEN, D. B.; MOORE, R. M. Assessment of apoptosis in epidermal lamellar cells in clinically normal horses and those with laminitis. American Journal of Veterinary Research, v. 65, n. 5, p. 578-585, 2004. HOTCHKISS, R. S.; NICHOLSON, D. W. Apoptosis and caspases regulate death and inflammation in sepsis. Immunology, v. 6, p. 813-822, 2006. NICHOLSON, D. W. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death & Differentiation, v. 6 p. 1028–1042, 1999. POLLITT, C. C. Basement membrane pathology: a feature of acute equine laminitis. Equine Veterinary Journal, v. 28, n. 1, p. 38-46, 1996. SOUZA, A.H. Aspectos clínico, fisiopatológico e terapêutico na laminite experimental em equinos. 2007. 219f. Tese (doutorado em Cirurgia Veterinária) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2007