Métodos em Microscopia Instituto Brasileiro de Medicina de Reabilitação Disciplina: Biologia Celular e Molecular Métodos em Microscopia Reações citoquímicas e imunohistoquímicas

Citologia: Métodos em Microscopia - Microscopia de luz - Microscopia de contraste de fase - Microscopia Confocal - Microscopia de fluorescência

Citologia: Métodos em Microscopia Microscopia Óptica (Campo claro) Oculares Objetivas Condensadora Macro /Micro Filtros Charriot

Células e tecidos → tratamento químico que garanta sua preservação Citologia: Métodos em Microscopia # Preparo de amostras Células e tecidos → tratamento químico que garanta sua preservação 1. Fixação 2. Desidratação 3. Emblocamento 4. Microtomia 5. Coloração

Citologia: Métodos em Microscopia # Coloração Hematoxilina-Eosina Hematoxilina: cora azul estruturas ácidas (núcleo) Eosina: cora rosa estruturas básicas (citoplasma)

Citologia: Métodos em Microscopia Espécimes transparentes???? Microscopia de Contraste de fase - Sistema de lentes - Luz muda de velocidade em estruturas com índice de refração diferentes - Estruturas mais claras e escuras - Células vivas

Microscopia de Contraste de fase

Imagens NÃO são compostas de 1 plano Superposições em foco simultâneo Citologia: Métodos em Microscopia Imagens NÃO são compostas de 1 plano Superposições em foco simultâneo Microscopia confocal - Plano focalizado de cada vez - Reconstrução tridimensional

Vasos sanguíneos da retina a partir do disco óptico

Glicogênio em neurônios

Citologia: Métodos em Microscopia Microscopia Fluorescência Anticorpos → ligação específica ao antígeno Localizar moléculas-alvo Direta: Anticorpo fluorescente (fluorocromo) Indireta: Adicionar um fluorocromo Microscópio de fluorescência Filtros seletivos → apenas a luz do corante usado é detectada

Citologia: Métodos em Microscopia # Imunocitoquímica Direta Reação antígeno-anticorpo auxiliando a localização de estrutura celulares Marcação direta

Coelho Marcação Direta Anticorpos + Ligante Antígeno

Imunocitoquímica:(anticorpo secundário) Marcação indireta Imunocitoquímica:(anticorpo secundário)

Flurocromo verde (1 canal) Vermelho e amarelo (2 canais)

Glomérulo: Anti-IgM C. botulinum T. cruzi

CÉLULA E SUAS ORGANELAS Instituto Brasileiro de Medicina de Reabilitação Disciplina: Biologia Celular e Molecular CÉLULA E SUAS ORGANELAS

CÉLULAS Unidades estruturais e funcionais dos organismos vivos Forma, tamanho e funções  Características estruturais = Células são as unidade estruturais e funcionais de todos os organismos vivos. Podem variar no tamanho, na forma e na função especializada. Apesar das diferenças, células de todas as espécies compartilham certas características estruturais. 20

Charles Darwin - On the Origin of Species (1859) “... De um começo tão simples, formas infindáveis, as mais belas e as mais maravilhosas, evoluíram e estão evoluindo.” Charles Darwin - On the Origin of Species (1859) EUCARIONTES: Ambientes extremos Patogênicas PROCARIONTES: Seres vivos são diferentes macroscópicamente Semelhanças: bioquímica, informação genética, produção de energia, síntese e degradação de blocos constituintes/biomoléculas (as vias metabólicas) As primeiras células surgiram há 3,5 bilhões de anos atrás em um ambiente rico em compostos orgânicos (anaeróbicas). Após o surgimento das células fotossintetizantes (produção de O2) surgiram organismos aeróbicos. Células eucarióticas surgiram 1,5 bilhões de anos (aumentaram de tamanho, compactação DNA, desenvolvimento de membranas). Archaea (arqueobactérias) são procariontes geralmente quimiotróficos, sobrevivem em lugares extremos (quentes, salino, pântanos, ambientes ricos em gás sulfídrico). Evoluíram a partir de uma bactéria e adquiriram algumas características dos eucariontes. 1º células surgiram há 3,5 bilhões de anos

PRINCIPAL DIFERENÇA ENTRE PROCARIONTE E EUCARIONTE? Células procarióticas (pro “antes”; karyon “núcleo”)  ausência de núcleo definido e organização interna simples. Procariotos são representados por bactérias (eubactérias) e archaea (arqueobactérias) Células eucarióticas (eu “verdadeiro)  núcleo definido limitado por membrana e estrutura interna complexa Membrana nuclear e organelas limitadas por membrana

Citoesqueleto e membranas COMO OS CONSTITUINTES CELULARES SÃO ORGANIZADOS NAS CÉLULAS? Procariontes Eucariontes Mesmo os organismos procariontes apresentam uma certa organização que é feita pelo citoesqueleto e membranas, apesar de não possuírem núcleo e nem membranas envolvendo as organelas. Procariontes - parede celular que contribui para organização celular da bactéria Citoesqueleto e membranas

CITOESQUELETO Estabiliza a forma celular, organiza o citoplasma e produz movimento CITOESQUELETO: formam uma rede tridimensional interligada em todo o citoplasma. É composto de subunidade protéicas simples que polimerizam para formar filamentos que sofrem montagens e desmontagem. Procariontes Eucariontes

CITOESQUELETO EUCARIONTES Diferem em: largura, composição e função Microfilamentos - contração muscular Actina (todas as células) e miosina Filamentos intermediários Vimentina (mesênquima), desmina (músculo liso), queratina (epitélio) Microtúbulos Tubulina (fuso mitótico) Três tipos gerais de citoesqueleto diferem em largura, composição e função específica. Todos fornecem estrutura e organização ao citoplasma e à forma da célula. São todos componentes de matriz extracelular. Actina e Tubulina ajudam a produzir a movimentação de organelas ou de toda a célula. Ex: Filamentos de actina ligam-se a membrana plasmática e confere forma e rigidez à superfície celular. Ligam-se a miosina (converte energia do ATP movendo o filamento de actina). Complexo actina-miosina formam um anel contrátil que divide o citoplasma em 2 durante a citocinese. Ex: Vimetina reveste vasos sanguíneos. Ex: Tubulina permite a separação dos cromossomos (fuso mitótico). Movimento de bater dos cílios e flagelos envolve microtubulos.

QUEM DELIMITA O QUE É INTRA OU EXTRA CELULAR? Superfície externa da célula está em contato com outras células, com o matriz extracelular, nutrientes, hormônios, fatores de crescimento e antígenos. Cultura de fibroblasto - em cinza é a matriz extracelular, composto por fatores de crescimento, hormônios importantes para interação célula-célula Células são os tijolos de uma casa em construção e o cimento é a matriz extracelular.

MEMBRANA PLASMÁTICA DELIMITA O QUE É INTRA OU EXTRA CELULAR

MEMBRANA PLASMÁTICA Componentes: Bicamada lipídica (colesterol, fosfolipídios) e proteínas imersas Funções: Limita o que é intra e extracelular Proteínas tem função de troca entre meio interno e externo (ex: canais, receptores) Troca pode ser com gasto de energia (transporte ativo) ou não (difusão simples) ou com auxílio de outras proteínas (difusão facilitada)

MEMBRANA PLASMÁTICA GLICOCÁLICE Regula o que entra e sai da célula (seletiva) “Antenas moleculares” altamente específicas GLICOCÁLICE Sensores ambientais que fazem a célula saber como se comportar a determinado estímulo. Na membrana estão presentes transportadores que levam nutrientes e retiram produtos residuais da célula. Os receptores da membrana apresentam sítios de ligação específico. Quando um ligante externo se une ao receptor, a proteína traduz o sinal em uma mensagem intracelular. Ex: receptor associado ao canal iônico permite a entrada de íons específicos na célula. Antígenos (vírus, bactérias) ligam-se a receptores específicos e desencadeiam a produção de anticorpos. Endocitose e Exocitose

MEMBRANA PLASMÁTICA TRANSPORTES DE MEMBRANA

QUAL COMPONENTE PREENCHE O CITOPLASMA? - Partículas e organelas - H2O, proteínas, sais minerais, aa, açúcares, precursores de ácidos nucléicos CITOSOL O citosol é o líquido que preenche o citoplasma, espaço entre a membrana plasmática e o núcleo das células vivas, que suporta bolsas, canais e organelas citoplasmáticas. É constituído por água, proteínas, sais minerais, iões diversos, aminoácidos livres e açúcares, enzimas, monômeros protéicos para produção de microtúbulos e filamentos de actina Conteúdo celular aquoso composto por partículas e organelas suspensas CITOSOL

COMPONENTES CELULARES? RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO: rede tridimensional que auxilia o ribossomo na secreção de proteínas. RUGOSO - local onde ocorre a tradução da proteína (ribossomo) de lá é encaminhada para o complexo de golgi LISO - síntese de hormônios (adrenalina, noroadrenalina), absorção de fármacos nas células do fígado

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO Rede intercomunicante de vesículas achatadas Membrana contínua

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO # Contínuo a membrana externa nuclear # Ribossomos # Secreção de proteínas

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO LISO # Contínuo ao rugoso # Síntese hormonal # Fármacos # Glicose-6-fosfatase Hidrólise do glicogênio

COMPLEXO DE GOLGI Direcionamento das proteínas “Correio” Proteínas são modificadas (adição na cadeia lateral dos aminoácidos de grupamentos sulfato, carboidratos e lipídios) COMPLEXO DE GOLGI (correio pque direciona a proteína para seu local de ação): empilhamento de vesículas achatadas com um lado voltado para o retículo endoplasmático rugoso e outro para a membrana plasmática. As proteínas recém-sintetizadas no ribossomo ligadas ao retículo endoplasmático rugoso são inseridas no complexo de Golgi onde são modificadas (adição na cadeia lateral dos aminoácidos de grupamentos sulfato, carboidratos e lipídios). Isto permite o endereçamento correto da proteína que é feito por uma vesícula de transporte.

COMPLEXO DE GOLGI

ESTRUTURAS RESPONSÁVEIS PELA DEGRADAÇÃO?

LISOSSOMOS Vesículas esféricas com grande número de grânulos Enzimas hidrolíticas Digerir moléculas sólidas (grandes)

# Originados no complexo de Golgi LISOSSOMOS # Originados no complexo de Golgi

LISOSSOMOS E A DIGESTÃO CELULAR ENDOCITOSE Fagocitose - Partículas sólidas - Estruturas de grandes dimensões  Pinocitose - Líquidos extra-celulares

FAGOCITOSE

PINOCITOSE

Peróxido de hidrogênio PEROXISSOMO # Reações oxidativas: radicais livres # Oxidam moléculas menores → retiram átomos de H Peróxido de hidrogênio PEROXISSOMO: reações oxidativas na degradação dos aminoácidos e gorduras produzem radicais livres e peróxido de hidrogênio (H2O2) podendo lesar a maquinaria celular. Para proteger a célula o peroxissomo engloba o H2O2 que é degradado pela catalase.

ORGANELA RESPONSÁVEL PELA PRODUÇÃO DE ENERGIA? MITOCRÔNDRIA: são as principais produtoras de ATP (principal molécula transportadora de energia das células) fornecendo energia para o trabalho celular.

MITOCÔNDRIA # Membrana Externa - lisa # Membrana interna - invaginada (cristas) # Matriz - solução aquosa com enzimas e substâncias envolvidas na produção de energia MITOCRÔNDRIA: são as principais produtoras de ATP (principal molécula transportadora de energia das células) fornecendo energia para o trabalho celular. Apresentam 2 membranas. A externa é lisa e envolve a organela. A interna apresenta invaginações (cristas). Dentro da membrana interna está a matriz (solução aquosa com enzimas e intermediários químicos envolvidos no metabolismo produtor de energia).

ATP Ácido Pirúvico MITOCÔNDRIA Produtoras de ATP → ???? GLICOSE Citosol CICLO DE KREBS ATP Ácido oxalacético

CENTRÍOLO # Estruturas cilíndricas # Microtúbulos # Divisão celular “Orientam" o deslocamento dos cromossomos

QUAL A FUNÇÃO DA MEMBRANA NUCLEAR? Informação Genética NÚCLEO: é envolto por 2 membranas e pelo retículo endoplasmático rugoso. Associados aos poros da membrana estão estruturas protéicas que permitem a entrada de moléculas sintetizadas no citoplasma e requeridas para replicação, transcrição e reparo do DNA. Produção e degradação simultânea de proteínas; especialização celular; reconhecimento e degradação de compostos estranhos (sem degradar compostos próprios da célula - Ex: degradação vírus sem degradar o DNA da própria célula).

NÚCLEO PRESENTE APENAS EM EUCARIONTES

DNA corpo poderia ser esticado até o Sol e voltar ~ 50 vezes NÚCLEO Terra Distância 1,5 x 1011 DNA corpo poderia ser esticado até o Sol e voltar ~ 50 vezes NUCLÉOLO: DNA contem muitas cópias dos genes que codificam o RNA ribossomal. CENTRÍOLOS: compostos de proteína tubulina que permite a migração dos cromossomos durante a divisão celular.

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