Propriedades Mecânicas Citoesqueleto Mobilidade Celular Propriedades Mecânicas Cap.9 Karp

Citoesqueleto e movimentação celular Filamentos intermédios Microfilamentos Polimerização e despolimerização dos microfilamentos Proteínas motoras: miosina. Estrutura e funções Mobilidade muscular e contracção Movimento celular Citoesqueleto e propriedades mecânicas das Células

FILMES MCB 1801 A – Célula em movimento MCB 1801 N – Mecanismo molecular do movimento, movimento de queratinócitos MCB 1801 V – Célula em movimento

Microtúbulos Citoesqueleto Transporte intracelular As células tratadas com drogas (colchicina, nocodazole) perdem a sua forma característica bem como por exemplo, o complexo de Golgi fica disperso na periferia da célula Pois impedem a organização dos microtubulos

Citoesqueleto Funções na célula

Citoesqueleto Movimentos Pseudopodos Lamelipodios

Citoesqueleto

Citoesqueleto Filamentos intermédios Microtubulos Microfilamentos diversas proteínas tubulina actina

Citoesqueleto

Citoesqueleto Filamentos de actina

Funções na célula Citoesqueleto Célula nervosa Célula epitelial Estrutura e suporte Transporte intracelular Contracção e mobilidade Organização espacial Filamentos de actina -MF intermédios Microtubulos Proteína motora Célula epitelial Célula nervosa Célula em divisão Proteína motora Filamento intermédio Microtubulo de actina

Citoesqueleto Peroxissomas em movimento

Fibroblastos Glóbulos Brancos Espermatozóides Citoesqueleto Funções na célula - Movimento Fibroblasto em movimento Fibroblastos Glóbulos Brancos Espermatozóides

Técnicas utilizadas Citoesqueleto Micro-injectada nas células Microscopia de Fluorescência Microfilamentos Microtubulos Tubulina fluorescente Utilizando anticorpos conjugados a fluorescência Micro-injectada nas células Vão constituir microtubulos

Citoesqueleto Tubulina marcada com rodamina

Técnicas utilizadas Citoesqueleto Nanotecnologia Microscopia e Vídeo Esferas microscópicas Permite medir forças desenvolvidas por uma só proteína motora Microtubulo Nanotecnologia Nano-máquinas com 10-100nm Proteína motora

Citoesqueleto Proteína motora alterada

Citoesqueleto Citoesqueleto insolúvel em detergentes não iónicos (Triton X-100) Permite fazer réplicas para visualizar ao Microscópio Electrónico Identificação dos diferentes elementos do citoesqueleto com base na morfologia e diâmetro dos filamentos Podem também ser utilizados anticorpos antes da cobertura metálica da amostra - identificação específica Microtúbulos

Microtúbulos Funções Citoesqueleto Esqueleto interno suporte estrutural posicionamento dos organitos Movimento de macromoléculas e organitos intracelulares Elementos motores de cílios e flagelos Separação dos cromossomas durante a mitose e a meiose.

Microtúbulos Citoesqueleto

Microtúbulos Citoesqueleto

Microtúbulos Citoesqueleto Estruturas tubulares ocas Diâmetro de 24 nm 13 protofilamentos heterodímeros de subunidades globulares de tubulina  e  Polaridade:  -tubulina numa extremidade (-)  -tubulina na outra extremidade (+) Extremidade (+) crescimento rápido Extremidade (-) crescimento lento (+) (-)

Microtúbulos Citoesqueleto

Microtúbulos Citoesqueleto Junção (-) (+) Junção GTP must be bound to both alfa and beta subunits for a tubulin heterodimer to associate with other heterodimers to form a protofilament or microtubule.

Microtúbulos Citoesqueleto Pi Actividade GTPase Subunit addition brings -tubulin that was exposed at the plus end into contact with -tubulin. This promotes hydrolysis of GTP bound to the now interior -tubulin. Pi dissociates. -tubulin within a microtubule cannot exchange its bound GDP for GTP. The GTP on -tubulin does not hydrolyze.

Citoesqueleto Each nucleotide in the protofilament is at an - interface. The inability of GTP to dissociate from the -subunit is consistent with occlusion by a loop from the -subunit. A similar occlusion would account for the inability of -tubulin within a protofilament to exchange GDP/GTP.

View an animation depicting assembly of microtubules. Citoesqueleto View an animation depicting assembly of microtubules. Then explore the structure of the a,b-tubulin heterodimer, using Chime.

3 locais de ligação a tubulina Microtúbulos Citoesqueleto Proteínas associadas MAP (microtubule associated protein). MAP 4 presente em vários tipos de células Domínio globular (cabeça) que se liga ao microtúbulo Domínio filamentoso que se projecta da superfície do microtúbulo Função: Ligam microtúbulos entre si Aumentam a estabilidade ou alteram a rigidez Influenciam a velocidade da sua organização Actividade é controlada por adição ou remoção de grupos fosfato (cinases e fosfatases) 3 locais de ligação a tubulina

Citoesqueleto Microtúbulos A Colchicina é um alcalóide que se liga aos dímeros da tubulina e impede a polimerização dos microtúbulos mais sensíveis como os do fuso mitótico. Ela é utilizada para se estudar células em mitose. O Taxol é um alcalóide utilizado no tratamento de tumores pois  também impede a mitose. Acelera a polimerização e estabiliza os microtúbulos, impedindo a despolimerização. Outras drogas utilizadas no tratamento de tumores, que também interferem com a dinâmica de microtúbulos,  são a Vincristina e a Vimblastina.

A distribuição dos microtúbulos na célula determina a sua forma Citoesqueleto Microtúbulos Suporte estrutural A distribuição dos microtúbulos na célula determina a sua forma Célula em cultura

Suporte estrutural e transporte Microtúbulos Citoesqueleto Suporte estrutural e transporte Porção de axónio evidenciando 2 vesículas que estavam a ser transportadas vesículas microtúbulos

Microtúbulos Citoesqueleto Transporte intracelular

Transporte de um organito ao longo de um axónio Citoesqueleto Microtúbulos Transporte intracelular Transporte de um organito ao longo de um axónio

Microtúbulos Motores moleculares ATP ATP (ATP  ADP+Pi) carga Local de ligação ATP (ATP  ADP+Pi) Convertem a energia química do ATP em energia mecânica Uma só célula contém dezenas destas proteínas motoras, especializadas para o movimento

Microtúbulos Motores moleculares Proteínas motoras Movimento unidireccional através do citoesqueleto Alterações conformacionais (ciclo mecânico) Tipos: cinesinas e dineínas (ao longo dos microtubulos) e miosinas (ao longo dos microfilamentos de actina) Carga (material a transportar): vesículas, mitocôndrias, lisossomas, cromossomas, filamentos do citoesqueleto

Cinesinas Proteínas Motoras Cadeias pesadas Cadeia leve Cabeça Zona flexível Braço Cauda Movimento de vesículas e organitos a partir do corpo celular para os terminais (por ex. sinápticos)

Cinesinas Proteínas Motoras Tetrâmero: duas cadeias pesadas e duas cadeias leves (380 kDa) Cabeças globulares: domínios de formação da força motriz (hidrólise de ATP) Caudas: ligação da carga Movimento: no sentido da extremidade positiva (b-tubulina) Movimento: ao longo de um microtubulo, com velocidade (1 m/s) - dependente da concentração de ATP

Cinesinas Proteínas Motoras

FILMES Cinesinas kinwalk_ribbon Proteínas Motoras Movimentos propostos (Simulação do movimento molecular) Cinesina monomérica ligada a GFP

Cinesinas Proteínas Motoras Microtubulos Verde - anticorpo anti-tubulina (Microtubulos) Amarelo - anticorpo anti-cinesina (identifica as vesículas associadas) Laranja - marcação dupla, correspondente aos 2 anticorpos Microtubulos Extremidade positiva no sentido da membrana plasmática Promovem movimento para “fora”

Dineínas Cabeça globular: Caudas: ligação da carga Proteínas Motoras Duas cadeias pesadas e diversas cadeias leves Cabeça globular: domínios de formação da força motriz Caudas: ligação da carga Movimento: sentido da extremidade negativa Movimento: para o centro da célula Carga: endossomas, lisossomas, vesículas do Golgi, movimento dos cromossomas na mitose...

Proteínas Motoras Dineínas Cadeias leves

Proteínas Motoras

Proteínas Motoras Cinesinas Dineínas

Dineínas Cinesinas Cada tipo de vesícula membranar é transportada Proteínas Motoras Dineínas Cinesinas Movimento: sentido da extremidade positiva (b-tubulina) Movimento: para o centro da célula, no sentido da extremidade negativa Carga: endossomas, lisossomas, vesículas do Golgi, movimento dos cromossomas na mitose... Um organito pode ligar cinesinas e dineínas simultaneamente embora actuem independentemente Cada tipo de vesícula membranar é transportada por uma cinesina específica

Microtubulos A função depende da orientação e localização dos microtubulos A formação dos microtubulos a partir dos dímeros de a /b-tubulina é realizada em duas fases: nucleação: fase lenta forma-se uma pequena porção elongação: fase rápida Centros Organizadores de Microtubulos (MTOCs) O melhor conhecido é o Centrossoma

Centros Organizadores de Microtubulos Centrossomas 2 Centríolos Material pericentriolar (PCM) Centríolos estruturas cilíndricas 0,2 mm Ø nove fibras fibra: 3 microtubulos A, B, C tubulo A: microtubulo completo e ligado à zona central (filamento radial periférico) 1 par por célula orientação perpendicular entre si

Centros Organizadores de Microtubulos Centrossomas centríolo

Crescimento dos microtubulos Centros Organizadores de Microtubulos Centrossomas Crescimento dos microtubulos Adição de dímeros à extremidade positiva crescimento em todas as direcções da célula extremidade negativa junto dos centríolos extremidade positiva exterior da célula

Centros Organizadores de Microtubulos Papel da -tubulina

Microtubulos Outros Centros Organizadores Corpos basais (com estrutura semelhante aos centríolos) estrutura base dos cílios e flagelos Funções dos MTOCs: controlo do número de microtubulos polaridade do microtubulo número de protofilamentos que os constituem tempo e localização de organização de novos microtubulos

Microtubulos Propriedades dinâmicas Microtubulos do aparelho mitótico ou do citoesqueleto estruturas lábeis (sensíveis à desorganização) Microtubulos dos axónios estruturas menos lábeis Microtubulos dos cílios e flagelos estruturas estáveis Do Citoesqueleto microtubulos polimerizam e despolimerizam rapidamente consoante as variações e necessidades da célula - Instabilidade dinâmica

Microtubulos Polimerização/Despolimerização Na polimerização Dímeros de GTP de GDP Polimerização Despolimerização Na polimerização Requer GTP ligada à subunidade b Hidrólise do GTP após incorporação do dímero no microtubulo (“fecho” do microtubulo) Na despolimerização Após a saída do dímero do microtubulo a molécula de GDP é substituída por GTP (dímeros/GTP disponíveis) Controlo independente da polimerização e despolimerização dos microtubulos A alteração conformacional resultante da hidrólise do GTP e do fecho do microtubulo fornecem a energia mecânica necessária para a destabilização do microtubulo.

A GTP cap stabilizes the (+) end of a microtubule. Hydrolysis of GTP by b-tubulin, as subunit addition brings it into contact with a-tubulin, takes time. A rapidly growing microtubule may accumulate a few layers of tubulin-GTP at the (+) end. A GTP cap stabilizes the (+) end of a microtubule. If [tubulin dimer] is low, dissociation of tubulin-GTP may expose tubulin-GDP at the (+) end, causing that end to be unstable. Rapid shrinkage ensues.

Fraying or curving of protofilaments is observed at the ends of rapidly disassembling microtubules. This may be due to a change in conformation when b-subunits of heterodimers at the plus end have bound GDP instead of GTP. Tubulin heterodimers with GDP on the b subunit form ring shaped assemblies in vitro. Straight protofilaments form only when both tubulins have bound GTP.

Microtúbulos Funções

Humanos Cílios Citoesqueleto Os flagelos dos procariotas são filamentos simples sem qualquer relação evolutiva com o dos eucariotas

Citoesqueleto Sistema flagelar

Sistema ciliar e flagelar Citoesqueleto Sistema ciliar e flagelar Túbulo B – incompleto (10-11 subunidades) Proteína elástica Túbulo A – completo (13 subunidades)

Citoesqueleto Túbulo A - completo

Centrosomal material also has an essential role in nucleating formation of cilia & flagella. The ciliary axoneme grows out from one centriole cylinder, called a basal body.

Cílos e flagelos têm origem num corpo basal Citoesqueleto Cílos e flagelos têm origem num corpo basal Túbulo A - completo Túbulo B e C – incompletos

Dineína do axonema (cílios e flagelos) Citoesqueleto

Dineína do axonema (cílios e flagelos) Citoesqueleto Ligação aos tubulos Actividade de ATPase

Citoesqueleto Dineína do axonema Deslocação alternada de cada metade do axonema

Dinâmica dos Microtubulos e Proteínas Motoras na Mitose (Cap 14 – Karp)

FILME MCB 1901V – Video Mitose MCB 1901 - Animação Mitose MCB 1902 Mitose-aspectos moleculares

Microtubulos e Aparelho Mitótico A mitose é o último passo do ciclo celular e demora cerca de 1h Neste período a célula constrói e desorganiza os microtubulos que constituem o aparelho mitótico Estrutura com a função de ligar e alinhar os cromossomas e de os separar para cada célula filha A separação dos cromossomas no ciclo mitótico tem 2 pontos de controlo cruciais: - ruptura do envelope nuclear no fim da profase - ligação dos microtubulos aos cinetocoros dos cramatídeos irmãos na fase de transição metafase-anafase

Cinetocoro Microtubulos e Aparelho Mitótico - localizado na superfície externa do centrómero de cada cromatídeo (mitótico) - local de ligação do cromossoma aos microtubulos do fuso mitótico - possuí várias proteínas motoras - promove o movimento dos cromossomas durante a mitose Cinetocoro Placa externa do cinetocoro Cinesina Dineína Microtubulo Fibra Corona fibrosa Zona intermédia Placa externa Placa interna

Microtubulos e Aparelho Mitótico -

Microtubulos e Aparelho Mitótico

Metafase Cinetocoro é um local com grande actividade, mesmo em plena metafase São adicionadas mais unidades de tubulina , do que as perdidas

Metafase Despolimerização lenta Cinetocoros Polimerização lenta Adição rápida de dimeros de tubulina Perda rápida de O encurtamento e o alongamento dos microtubulos para dispor os cromossomas na ”placa equatorial”

Anafase

Citoesqueleto Filamentos intermédios Microtubulos Tubos rígidos constituídos de subunidades da proteína tubulina Filamentos intermédios Fibras com uma estrutura do tipo corda constituídas por diversas proteínas Microfilamentos Estruturas sólidas e finas compostas da proteína actina

Filamentos intermédios Citoesqueleto Monómero Dímero Tetrâmero Estrutura do filamento intermédio Filamentos intermédios 10 nm  Não ramificados Tetrâmero formado por dois dímeros com orientação antiparalela Proteínas de diferentes tipos Tetrameros associados - Sem polaridade Resistentes a forças de tensão Queratina, nestina, vimentina, desmina, laminina, NF-L(M,H)

Citoesqueleto Filamentos intermédios Células epiteliais queratina Tipo I e Tipo II Células nervosas neurofilamentos (NF-L, NF-H, NF-M) suporte Filamentos intermédios de queratina

Citoesqueleto

Citoesqueleto

Citoesqueleto Inicialmente pensou-se que os FI eram estruturas permanentes. Posteriormente verificou-se que actuam de uma forma dinâmica “in vivo” Injectando culturas de células epiteliais com subunidades de queratina marcadas com fluorescência, elas são rapidamente incorporadas nos filamentos intermédios existentes A incorporação faz-se não na extremidade dos filamentos, mas no seu interior Existe então um “pool” de subunidades de queratina que estão em equilíbrio dinâmico com as suas formas polimerizadas

Citoesqueleto Microfilamentos 8 nm  Subunidades globulares de actina Requer ATP para polimerizar Dupla hélice de filamento de actina Polaridade Proteína principal na contracção muscular Proteína muito abundante em todas as células, em especial nas células motoras

Citoesqueleto

Citoesqueleto - + Polimerização dos microfilamentos Monómero de actina liga ATP ATP é hidrolisado algum tempo após a incorporação no novo filamento S1 da miosina Extremidade positiva – crescimento rápido Extremidade negativa - crescimento lento

FILMES MCB 1802 – polimerização da G-actina

Citoesqueleto Polimerização dos microfilamentos Equilíbrio entre subunidades livres e filamento – controlo na reorganização do citoesqueleto de microfilamentos Processos dinâmicos: movimento celular, alterações da forma celular, citocinese. Exemplos de movimento celular através da polimerização da actina - Espermatozóide – reacção acrossomal (Formação de pequeno filamento na zona frontal formado por polimerização dos monómeros de actina). - Propulsão da bactéria Listeria monocytogenes no citoplasma de um fagócito actina

Miosina-Proteina Motora Citoesqueleto Miosina-Proteina Motora Proteína Motora dos Microfilamentos Movimento para a extremidade positiva do microfilamento. Fragmento S1 Cadeia leve Cabeça Cadeia leve reguladora Cauda Miosina II

Miosina-Proteina Motora Citoesqueleto Miosina-Proteina Motora Cadeias leves Cadeias pesadas Miosina II Associação de miosinas formando um filamento bipolar Contracção muscular Filamento bipolar

Ver video Karp Citoesqueleto Contracção muscular Músculo esquelético Feixe de células musculares Músculo esquelético Célula muscular ou fibra Composta por miofibrilhas. Miofibrilas - unidades contrácteis: sarcómeros Sarcómeros: filamentos finos (actina) e grossos (miosina) Baínha Fibra muscular Núcleo Miofibrila Linha Z Banda I Sarcómero Banda A Banda I Ver video Karp

FILME MCB 1804 Demonstração experimental do movimento Citoesqueleto Contracção muscular MCB 1804 Demonstração experimental do movimento

Sarcómeros Citoesqueleto Banda I Banda A Zona H Ext. negativa Linha Z Ext. positiva Ext.positiva Filamento de actina Filamento grosso Miosina

Modelo de contracção muscular Citoesqueleto Modelo de contracção muscular Contracção por encurtamento do sarcómero Contracção: banda A permanece inalterada (corresponde à miosina), bandas I e H diminuem Linhas Z movem-se para o centro do sarcómero Contracção: deslizamento de filamentos de actina e miosina

Modelo de contracção muscular Citoesqueleto Modelo de contracção muscular Filamentos finos: actina , tropomiosina e troponina Troponina: composta por 3 subunidades, espaçada cada 7 subunidades de actina Tropomiosina: molécula filamentosa encaixa nas depressões da hélice de actina Actina Tropomiosina Troponina

Modelo de contracção muscular Citoesqueleto Modelo de contracção muscular Contracção cabeça da miosina movimenta-se para fora e liga-se ao filamento de actina, formando pontes transversais 1 filamento de miosina liga-se a 6 filamentos de actina após ligação a cabeça da miosina dobra-se para o interior do sarcómero movimento do filamento de actina 5 a 15 nm sobre o filamento de miosina miosina Filamento de actina Cabeça

Citoesqueleto Energética da contracção muscular Miosina requer energia do ATP para conversão da energia química em mecânica Ciclo de formação de pontes transversais – 50 msegundos Ligação de ATP – dissociação com filamento de actina Hidrólise do ATP em ADP+Pi Absorção da energia libertada e ligação à actina 4.Liberta o fosfato, altera conformação, impulsiona o filamento de actina para o centro do sarcómero 5. ADP dissocia-se da miosina, liga-se novo ATP

Citoesqueleto Energética da contracção muscular Rigor mortis sem ATP

Citoesqueleto Regulação da contracção muscular Troponina Tropomiosina Relaxado – tropomiosina bloqueia local de ligação da miosina à actina Posição da tropomiosina é controlada pela troponina Cálcio aumenta, liga-se à troponina Deslocamento da tropomiosina Exposição do local de ligação da miosina Após a estimulação nervosa ocorre a remoção do cálcio do citoplasma Cálcio dissocia-se da troponina Tropomiosina bloqueia a ligação da miosina Actina

Actina, miosina e citocinese Citoesqueleto Actina, miosina e citocinese Citocinese divisão das células após divisão dos cromossomas Anel contráctil mesmo local da placa equatorial microfilamentos e miosina contração até à união das duas membranas

Actina, miosina e citocinese Citoesqueleto Actina, miosina e citocinese Anel contráctil Actina Miosina

Citoesqueleto

Citoesqueleto Doenças associadas a alterações do citoesqueleto Microfilamentos Produtos de fungos como as citocalasinas e as faloidinas interferem com a dinâmica de polimerização e despolimerização da actina, interferindo com o movimento celular. As citocalasinas ligam-se à actina impedindo a polimerização, enquanto as faloidinas ligam-se lateralmente aos microfilamentos estabilizando-os. Filamentos intermediários A disposição dos filamentos intermediários depende da presença de microtúbulos.

Microvilosidades com actina Citoesqueleto Microvilosidades com actina

Citoesqueleto

Citoesqueleto

Citoesqueleto

Proteínas Periféricas Citoesqueleto Família das Espectrinas - Servem de esqueleto membranar - Suporte às proteínas integrais