Replicação do DNA Centro de Ciências Exatas e da Natureza

Apresentação em tema: "Replicação do DNA Centro de Ciências Exatas e da Natureza"— Transcrição da apresentação:

1 Replicação do DNA Centro de Ciências Exatas e da Natureza
Departamento de Biologia Molecular Curso: Ciências Biológicas Disciplina: Genética Molecular Replicação do DNA Eleonidas Moura Lima

2 Transferência da informação genética
transcrição tradução DNA RNA PROTEÍNA duplicação

3 REPLICAÇÃO DO DNA

4 Watson e Crick (1953) Modelo da Dupla Hélice
Fitas velhas - molde Fitas novas Modelo da Dupla Hélice Sugeria duplicação semi-conservativa

5 Modelos de duplicação do DNA
Hipótese 1 Hipótese 2 Hipótese 3 Semi-conservativa Conservativa Dispersiva

6 Meselson e Stahl (1958) DNA pesado (15N) DNA híbrido (15N/ 14N) DNA leve (14N) DNA híbrido Molécula mãe original Primeira geração de moléculas filhas Segunda geração de moléculas filhas Centrifugação em gradiente de densidade de CsCl meio com N pesado (15N) meio com N leve (14N) Replicação conservativa 1a geração Replicação dispersiva 2a geração

7 Duplicação em procariotos
Para as fitas velhas funcionarem como molde, a dupla hélice precisa ser aberta. Várias origens ou uma única ? Cairns, 1963 Em procariotos, existe uma única origem de duplicação

8 Forquilha de duplicação
Sentido da duplicação Cairns, 1963 Bidirecional Unidirecional Forquilha de duplicação Pulsos de timidina H3 antes do término da duplicação : marcação radioativa visualizada nas duas forquilhas de duplicação A duplicação é bidirecional

9 Sítios de ligação da proteína DnaA
A sequência da origem é casual ou existe uma sequência consenso ? Origem da replicação : Seqüência específica para ligação de proteínas iniciadoras (promovem abertura da dupla hélice) Sítios de ligação da proteína DnaA Seqüências de 9 pb Seqüências de 13 pb Ricas em AT Menor gasto de energia para separar as fitas

10 Uma vez que a dupla hélice está aberta, como é feita a síntese da nova fita ?
DNA polimerases Kornberg (1957) : DNA polimerase I Requerimentos da DNA pol I para sintetizar nova fita de DNA : Desoxinucleotídeos trifosfatados Íons Mg2+ DNA pré-existente, para servir como molde Uma extremidade OH-3’ de uma cadeia de DNA pré-existente para realizar a ligação fosfodiéster 10

11 Ligação fosfodiéster Extremidade 5’ da nova fita de DNA DNA pol I
Extremidade OH-3’ livre da nova fita de DNA Extremidade 5’ da nova fita de DNA DNA pol I A síntese ocorre sempre no sentido 5’ 3’

12 O problema da iniciação
DNA pol I não consegue iniciar a síntese da nova fita – ausência de extremidade OH-3’ livre. Primer Primase : sintetiza oligonucleotídeo (primer) de RNA, fornecendo a extremidade OH-3’ livre para a DNA pol I 5’ 3’

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14 A DNA pol I possui outras atividades enzimáticas :
Atividade exonucleásica 3’-5’ Atividade exonucleásica 5’-3’ Nuclease : degrada ác. nucleico Exonuclease : cliva extremidades Endonuclease : cliva ligações internas

15 Outras DNA polimerases foram descobertas :
DNA pol II : Reparo do DNA Atividade polimerase 5’-3’ Atividade exonuclease 3’ – 5’ DNA pol III : Possui várias subunidades Atividade polimerase 5’- 3’ Atividade exonuclease 3’ – 5’ DNA polimerase IV e V – envolvidas em diferentes processos de reparo. 15

16 Processividade : habilidade da enzima de repetir a sua função catalítica sem dissociar-se do seu substrato Para a DNA pol : Definida pelo no médio de nt incorporados sem que a DNA pol se dissocie do DNA molde As DNA pol diferem em processividade

17 DNA pol III : a enzima responsável pela replicação em procariotos
: polimerase  : proofreading  A holoenzima DNA pol III     Núcleo catalítico mínimo Mantém a enzima ligada ao DNA Liga dois núcleos catalíticos Complexo “clamp-loading” Subunidade  : aumenta a processividade da DNA pol III

18 Duplicação do DNA : um processo de alta fidelidade
E. coli – 1 erro a ~ cada 109 bases adicionadas ou a após mil ou 10 mil eventos de replicação DNA polimerase tem um sítio ativo que só se fixa quando as bases estão pareadas corretamente DNA polimerase tem capacidade de verificar a fidelidade da replicação na cadeia nascente (proofreading) e corrigir os erros (atividades exonucleásicas) Depois da replicação, existe um sistema de reparo que corrige qualquer erro de pareamento de bases

19 Duplicação do DNA : um processo de alta fidelidade
Pareamento incorreto : Geometria diferente Não acomoda-se no sítio ativo da DNA pol

20 DNA pol I Sítio ativo da atividade polimerase Sítio ativo da atividade exonucleásica 3’5’ (proofreading) Forma rara da C Pareia-se com A C na forma rara volta para a forma normal – pareamento inadequado Bloqueio da duplicação Pareamento errôneo localizado no sítio da atividade exonucleásica O nucleotídeo mal pareado é removido DNA pol reassume a atividade polimerase 20

21 A síntese é contínua numa fita e descontínua na outra...
Direção em que as fitas se estendem 3’ 5’ 5’ 3’ DNA pol só age no sentido 5’- 3’ !!! Direção em que as fitas se estendem 3’ 5’ Fita líder (contínua) Fita descontínua 5’ 3’

22 Síntese dos primers na fita descontínua

23 SSBs (single strand binding proteins)
Abertura e desenrolamento do DNA Helicase Topoisomerase SSBs (single strand binding proteins)

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25 Início da duplicação Ori C Dna A une-se às repetições de 9 pb
Formação de um complexo de Dna A Fitas se separam na região das repetições de 13 pb Dna C Dna B (helicase) 25

26 Início e elongamento 3’ 5’ Topoisomerase Helicase SSBs 5’
Holoenzima DNA pol III Primase DNA pol I 3’ Ligase

27 Duplicação em eucariotos
O ciclo celular

28 Várias origens de duplicação
Genoma humano – ~ 10 mil locais de origem (maior velocidade de replicação)

29 Tipos de DNA polimerases (Eucariotos)
RPA POLIMERASE γ Núcleo Atividade de polimerização e primase Sem atividade exonuclease 3’-5’  Fita descontínua Núcleo Atividade de polimerização e exo 3’-5’ Sem atividade primase Núcleo Atividade de exonuclease 3’-5’ (~ DNA Poli I) Reparo de lesões provocadas por UV Núcleo Atividade semelhante à das SSB de procariotos Mitocôndria Replicação do genoma mitocondrial

30 O aparato de replicação eucarioto
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31 O problema da duplicação no final da fita do DNA
5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ DNA pol. 3’ gap

32 A telomerase Telomerase Template interno Polimerização Translocação
Nova polimerização Fita molde Fita nova primase

33 Replicação do DNA Bons Estudos
Centro de Ciências Exatas e da Natureza Departamento de Biologia Molecular Curso: Ciências Biológicas Disciplina: Genética Molecular Replicação do DNA Bons Estudos Eleonidas Moura Lima