Replicação do DNA Bibliografia: Genes VII - Benjamin Lewin Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha Lenhinger Principles of Biochemistry (3a. Ed.) Agradecimentos:

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1 Replicação do DNA Bibliografia: Genes VII - Benjamin Lewin Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha Lenhinger Principles of Biochemistry (3a. Ed.) Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP

2 Replicação do DNA O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA. A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases

3 A replicação do DNA é semi-conservativa Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958 Cultivo em meio 14 NH 4 Cl Cultivo em meio 15 NH 4 Cl Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl

4 A replicação é bidirecional

5 A replicação do cromossomo circular

6 Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação Replicon: 1.Origem + Término 2.Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular 3.O genoma de uma célula procariótica constitue um único replicon 4.Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente

7 A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado

8 O genoma bacteriano circular constitue um único replicon A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)

9 Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação

10 O genoma eucariótico constitue vários replicons A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática

11 Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas

12 Fita contínua (líder) Fita descontínua

13 Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3´OH da cadeia em crescimento. O precursor da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato Sentido da síntese sempre é 5’  3’ A replicação é um processo extremamente fiel. As DNA- polimerases tem atividade revisora

14 Desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato (precursor) Fita sendo polimerizada Fita molde

15 As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado

16 Pareamento de bases correto incorreto

17 Atividade revisora 3’  5’ garante a fidelidade da replicação

18 Modelo da estrutura das DNA-polimerases

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20 Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas Pol IPolIIPolIII Polimerização 5’  3’ + + + Exonuclease 3’  5’ + + + Exonuclease 5’  3’ + - - Número de subunidades 1  4  10 Tamanho em kDa 103 90 ~900 Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000 Processividade 3-200 1500  500000 (nt adicionados antes da dissociação do molde)

21 DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica

22 A subunidade Beta da DNA- polimerase III envolve o duplex das fitas-filhas

23 OriC do cromossomo de E.coli

24 Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli DnaAReconhece a origem e abre a dupla fita em sítios específicos DnaB (helicase)Desenrola o DNA DnaCAuxilia a ligação de DnaB na origem HUProteína do tipo histona que estimula a iniciação Primase (DnaG)Sintetiza os primers de RNA Single strand binding (SSB) Liga a fita simples de DNA RNA polimeraseFacilita a ação da DnaA DNA giraseAlivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita Dam MetilaseMetila as sequências GATC na OriC

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27 A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA Fita contínua Fita descontínua Síntese da Fita descontínua Síntese da Fita Contínua

28 Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas A DNA ligase sela as quebras

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31 Mecanismo de ação da DNA ligase

32 Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E.coli SSBLiga a fita simples de DNA DnaB (helicase)Desenrola o DNA Primase (DnaG)Sintetiza os primers de RNA DNA Polimerase IIISintese da fita nova DNA Polimerase IPreenche as lacunas e excisa os primers DNA LigaseLiga os fragmentos DNA giraseSuperenrolamento

33 Síntese das fitas contínua e descontínua é independente

34 O complexo de replicação A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas O primossomo afasta uma das fitas molde Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas

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37 Duplicação dos cromossomos Separação dos cromossomos e divisão celular