Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Graduação em Biotecnologia Disciplina de BIOPROCESSOS Profa. Dra. Patrícia.

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1 Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Graduação em Biotecnologia Disciplina de BIOPROCESSOS Profa. Dra. Patrícia S. Diaz Biorreatores

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3 Classificação dos Biorreatores
Denominam-se biorreatores, reatores bioquímicos ou reatores biológicos, os reatores químicos nos quais ocorrem uma série de reações químicas catalisadas por biocatalisadores. Os biocatalizadores podem ser enzimas ou células vivas (microbianas, animais ou vegetais). Classificação dos Biorreatores Encontram-se na literatura várias formas de classificar os biorreatores, como por exemplo: Quanto ao tipo de biocatalisador: - reatores enzimáticos: as reações ocorrem na ausência de células vivas; - reatores com células vivas: as reações ocorrem na presença de células vivas; Quanto a configuração do biocatalisador: células / enzimas livres ou imobilizadas; Quanto a forma de se agitar o líquido no reator.

4 90% do biorreatores utilizados industrialmente
Classificação geral dos biorreatores Classificação mista, mais abrangente que as anteriores. 90% do biorreatores utilizados industrialmente

5 Tipos de Biorreatores Coluna de bolhas STR Air-lift
Células imobilizadas leito fixo Células imobilizadas leito fluidizado Plug-flow Membranas planas Fibra oca (Hollow-fiber)

6 STR: consiste em um tanque cilíndrico com agitação mecânica
STR: consiste em um tanque cilíndrico com agitação mecânica. O agitador é montado num eixo central do fermentador, possuindo, ao longo de sua altura, uma série de turbinas, as quais podem ser de diferentes tipos. Reatores agitados pneumaticamente (b e c): se caracterizam basicamente pela ausência do agitador mecânico, sendo a agitação do líquido efetuada apenas pelo borbulhamento de um gás (normalmente ar) no reator. Menores tensões de cisalhamento  cultivo de células animais e vegetais. (b) Bubble column: coluna de bolhas tem movimento aleatório do líquido dentro do reator. (c) Air-lift: movimentação cíclica do líquido através de dispositivos e arranjos internos construídos com esse propósito.

7 Fluxo pistonado (plug-flow): o inóculo e meio de cultura são misturados na entrada do sistema, sem haver mistura longitudinal. Ocorre variação na concentração dos nutrientes e das células ao longo do comprimento do reator. Células / enzimas imobilizadas: o biocatalisador se encontra imobilizado em um suporte inerte como, por exemplo, alginato, ágar, K-carragena, pectina, vidro, sílica, etc. A finalidade de utilizar células / enzimas imobilizadas é a manutenção de elevadas concentrações celulares  elevadas produtividades. Dependendo da movimentação das partículas, os reatores se dividem em: Leito fixo (e): a movimentação é praticamente inexistente; Leito fluidizado (f): há movimentação intensa das partículas, sendo que a fluidização do leito pode ser feita por injeção de ar, gás inerte ou pela recirculação do líquido do reator.

8 Células confinadas entre membranas: os biorreatores de lâminas de membranas planas e de fibra oca caracterizam-se por manterem as células confinadas entre membranas semipermeáveis (“entrepped biocatalyst”), as quais permitem o fluxo de líquido mas não de células. Ocorre a passagem dos nutrientes e produtos através da membrana (reator de perfusão). Estes tipos de reatores prevêem a separação entre fluxos de nutrientes e produtos metabólicos, o que permite uma primeira operação de separação do produto desejado, contribuindo para o processo de purificação do produto (downstream processes).

9 Capacidade dos biorreatores - industrial
É bastante variável, conforme o processo em questão. Podem ser distintos em três grupos: Pequena escala: centenas de litros até 1 a 2 m3 de capacidade. Utilizados no cultivo de microrganismos patogênicos e crescimento de células animais ou vegetais, objetivando a produção de produtos ligados a área da saúde. Escala intermediária: dezenas de m3 a m3 de capacidade. Utilizados na produção de enzimas, antibióticos e vitaminas. Grande escala: milhares de m3 de capacidade. Utilizados em fermentação alcoólica ou tratamento de resíduos. Lembre-se que: 1 m3  1000 L.

10 Formas de Condução de um Processo Fermentativo
Quando se pensa em um processo fermentativo, imagina-se: 1° - Preparar certo meio de cultura (adequado a nutrição e desenvolvimento dos microrganismos, bem como ao acúmulo do produto desejado); 2° - Colocar este meio de cultura no fermentador e esterilizar; 3° - Preparar o inóculo, escalonar e adicionar ao fermentador (inocular); 4° - Aguardar o tempo necessário para que o processo ocorra, controlando pH, oxigênio e espuma; 5° - Descarregar o fermentador; 6° - Executar as operações unitárias necessárias para a obtenção do produto. A descrição acima é típica de um processo de fermentação descontínuo simples, ou descontínuo tradicional, também chamado de processo em batelada. Entretanto, são várias as maneiras de se conduzir um processo fermentativo industrial, o qual visa a maior obtenção de produto com menor custo.

11 De um modo geral, um biorreator pode ser operado das seguintes formas:
Descontínuo com um inóculo por tanque com recirculação de células Semicontínuo sem recirculação de células Descontínuo alimentado (“fed batch”) Contínuo executado em um biorreator executado em vários biorreatores sem recirculação de células com recirculação de células

12 Descontínuo Seu modo de operação pode ser descrito assim: no início o meio de cultura esterilizado dentro do biorreator é inoculado com o microrganismo e incubado, de modo a permitir que a fermentação ocorre sob condições ótimas. No decorrer do processo nada é adicionado ao biorreator a não ser oxigênio - ar (processo aeróbio), antiespumante e solução para o controle do pH. Terminada a fermentação, descarrega-se a dorna e o caldo fermentado segue para os tratamentos finais (downstream processes). Com um inóculo por tanque Com recirculação de células: centrifugação, sedimentação ou separação por membranas. Primeiro Segundo Terceiro

13 Processo de sedimentação (decantação) Produção de aguardente

14 Características do Processo Descontínuo
1 – Volume no biorreator permanece constante: se não houver adição de soluções para o controle do processo, nem perda de líquido por evaporação, o volume no decorrer da fermentação permanece constante; 2 – Baixos rendimentos ou produtividade: quando o substrato adicionado de uma só vez no início da fermentação exerce efeitos de inibição, repressão, ou desvia o metabolismo celular a outros produtos que não interessam; 3 – Tempos mortos: tempos em que o biorreator não está sendo usado para o processo fermentativo propriamente dito, tais como tempo de carga e descarga de dorna e período correspondente a lavagem e esterilização do fermentador; 4 – Riscos de contaminação menores, em comparação ao processo contínuo; 5 – Flexibilidade de operação: pode-se utilizar os fermentadores para a obtenção de diferentes produtos; 6 – Mais utilizado na indústria de alimentos: usado na produção de iogurte, chucrute, picles, cerveja, vinho, etc.

15 Classificação do Processo Descontínuo
Em escala industrial, muitos processos são adaptados com vistas a otimizar a produção. O processo descontínuo, por sua vez, também pode ser adaptado de modo a atender ao objetivo de diferentes indústrias. Os processos descontínuos podem ser classificador em três grandes grupos, de acordo com o modo de inoculação: 1) Culturas puras - inoculação de uma dorna com um microrganismo que foi propagado a partir de uma cultura pura; 2) Recirculação do microrganismo – reaproveita-se como inóculo o microrganismo da batelada anterior. Sedimentação do microrganismo – destilarias de álcool; Separação das células por centrifugação. Por meio de cortes - opera-se da seguinte maneira: inocula-se uma cuba (chamada de A), quando a fermentação atinge um determinado estágio, passa-se parte do conteúdo para uma dorna vazia (chamada B) e, em seguida, enchem-se as duas com meio de cultivo. Essa operação é chamada de cortes. Diz-se que a dorna A foi cortada para a dorna B.

16 Descontínuo alimentado: processo onde um ou mais nutrientes são adicionados durante o cultivo – metabolismo deslocado. É aquele no qual inicialmente se introduz o inóculo, o qual deve ocupar de 10 a 20% do volume útil. Após alimenta com o meio de cultura, sem a retirada do caldo fermentado. Depois do preenchimento do volume útil do biorreator se inicia a retirada do caldo fermentado para a obtenção do produto. Uma variação é a recuperação das células (centrifugação, sedimentação ou separação por membranas), retornado ao biorreator, gerando economia no preparo do inóculo no custo e tempo.

17 Classificação do Processo Descontínuo Alimentado
Devido á diversidade de aplicações do processo descontínuo alimentado, algumas variações podem decorrer com a finalidade de ajustá-lo á produção de diversos produtos obtidos por fermentação. 1) Descontínuo alimentado repetitivo: uma fração constante de volume de cultura é removida a intervalos de tempo fixos. De tempos em tempos retira-se um volume fixo de caldo fermentado, sendo recolocado mosto para completar o volume de fermentação. Enchimentos e esvaziamentos repetidos de volumes específicos resultam em uma operação cíclica de variação de volume dentro do fermentador. Assim, pode-se denominar de processo descontínuo alimentado cíclico. Tem como objetivo aproveitar como inóculo o microrganismo que está crescendo com alta velocidade de crescimento e de trabalhar com células que estão na fase produtiva por mais tempo, levando ao aumento de produtividade do sistema. 2) Descontínuo alimentado estendido: a concentração de substrato limitante é mantida constante no meio de fermentação pelo suprimento contínuo do nutriente. Tem como objetivo estender o período de fermentação, mantendo níveis de concentração de substrato no biorreator adequados para que as células com a atividade fermentativa direcionada para a formação do produto desejado.

18 Semicontínuo: após o término da fermentação, parte do caldo fermentado é retirado e adicionado o mesmo volume de meio de cultura. Operação por choques de carga de substrato. Diferencia-se do processo descontínuo alimentado por ter uma recarga no fermentador de modo instantâneo.

19 Contínuo Sistema aberto no qual estabelece um fluxo contínuo de líquido através do biorreator. O meio a ser introduzido deve ser esterilizado, assim como se deve manter as condições de assepsia nas operações de alimentação e retirada do caldo fermentado. Com um tanque Com tanques em série: a alimentação de um dado biorreator da série é o efluente do biorreator anterior a este.

20 Processo Contínuo com biorreatores em série
A distribuição de meio de cultura nos diferentes biorreatores pode levar a diferentes condições de fermentação entre os biorreatores. O reciclo de células pode ser realizado tanto em um único biorreator quanto nos biorreatores em série, em qualquer deles.

21 Fluxograma do processo de produção de álcool em modo de operação contínuo com múltiplos estágios e com recirculação de células

22 Levedura seca inativa:
Levedura seca obtida da fermentação de caldo de cana de açúcar, destinada à compor rações para alimentação animal (aves, peixes, suínos, camarões, rações extrusadas para cães e gatos) com elevado conteúdo protéico. A Usina Açucareira São Manoel é uma tradicional unidade industrial produtora de cana, açúcar, etanol e levedura seca. Esmaga atualmente 3,3 milhões de ton de cana para produzir 225 mil ton de açúcar, 142 milhões de L de etanol e ton de levedura por ano.

23 IMPOSSÍVEL DE SE OBTER NA PRÁTICA!!!
A manutenção de volume constante de líquido no biorreator é de primordial importância, a fim de o sistema atinja a condição de estado estacionário ou regime permanente (“steady state”), condição na qual as variáveis de estado (concentração de células, de substrato limitante e de produto) permanecem constante ao longo do tempo de operação do sistema. A manutenção de volume constante requer:  Sistema de retirada de líquido por transbordamento (ladrão);  Bombas de alta vazão instaladas na saída, acionadas intermitentemente. Vazão de Alimentação Biorreator Vazão de Retirada IMPOSSÍVEL DE SE OBTER NA PRÁTICA!!!

24 Outro fator que afeta a manutenção de volume constante de líquido no biorreator é a formação de espuma. A formação de espuma pode ser controlada com a adição de antiespumante (antifoam), ou através de sistemas mecânicos de quebra de espuma. Antiespumantes são agentes teso-ativos, que atuam na interface ar-líquido, modificando ou impedindo a formação de bolhas. Antiespumantes – óleos vegetais neutros, lanolina bruta, álcoois superiores, poliálcoois e silicone líquido.

25 Fermentação em Estado Sólido

26 Fermentação em Estado Sólido
Essa forma de processo também pode ser denominada de fermentação em substrato sólido, fermentação em meio semi-sólido ou fermentação semi-sólida. Como abreviaturas são conhecidas FES, FSS e FMS. A fermentação em estado sólido pode ser definida como: “Processos que referem-se a cultura de microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz sólida (substrato ou material inerte), onde o conteúdo de líquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela está a um nível de atividade de água que, por um lado, assegure o crescimento e metabolismo das células e, por outro, não exceda a máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida”. “O termo fermentação em estado sólido aplica-se ao processo de crescimento de microrganismos sobre substratos sólidos sem a presença de água livre. A água presente nesses sistemas encontra-se ligada à fase sólida, formando uma fina camada na superfície das partículas”.

27 Microrganismos comumente utilizados Mos em seu estado natural
Os processos de fermentação em estado sólido podem utilizar: Qualquer microrganismo pode ser utilizado em fermentações sólidas (Bactérias, leveduras ou fungos). Devido aos baixos níveis de água no sistema, os fungos filamentosos apresentam melhor capacidade de crescimento nestas condições. Mos em seu estado natural Culturas puras Culturas mistas Fotografia de Aspergillus oryzae sobre farinha de trigo

28 Substratos: composição
O termo fermentação em estado sólido remete a dois tipos de materiais insolúveis em água, sobre os quais os microrganismos irão crescer: Quando o suporte sólido atua ele próprio como fonte de nutrientes; Os nutrientes são solúveis em água e os microrganismos estão aderidos a uma matriz sólida, inerte ou não, que irá absorver o meio de cultura líquido. Exemplos: Produção de esporos de Aspergillus niger em sabugo de milho umedecido com solução de sacarose; Utilização de solução de glicose e nutrientes umedecendo bagaço de cana para a produção de ácido lático; Obtenção de álcool etílico em bagaço de cana umedecido com melaço. A maioria dos processos usam o princípio em que o suporte atua também como fonte de nutrientes

29 Substratos: composição – exemplos
Diversas matérias-primas, dentre estas, principalmente diversos tipos de resíduos agroindustriais, podem ser empregados na fermentação sólida. A escolha de cada meio, logicamente, irá depender do produto final que se deseja obter. Pode-se exemplificar os seguintes materiais: Materiais Produção de Celulose, hemicelulose e lignina Compostos orgânicos Farelo e palha de trigo, farinha e farelo de soja, farinha de mandioca, palha e quirera de arroz, melaço e bagaço de cana Enzimas Sorgo, polpa de beterraba, grits de milho, bagaço de maça, de uva, quirera de arroz, melaço de cana Álcool Resíduos de banana, farinha, resíduos sólidos do processamento de mandioca, espiga de milho, bagaço de laranja, cana-de-açúcar, bagaço de cana, melaço, vinhaça, farelo e palha de trigo, grão-de-bico, beterraba, polpa de café, polpa de batata doce, arroz cozido e folha de maple Enriquecimento protéico Bagaço de cana, água de maceração de milho, lactose, sacarose e farelo de trigo Antibióticos Grãos de milho, alfafa e aveia, grãos de sorgo, soja, trigo, amendoim, milho e arroz Verificação de produção de toxinas Farelo de trigo, beterraba, bagaço de cana e melaço Ácidos orgânicos Soja (hamanatto, tempeh, miso, natto, shoyu), pasta de amendoim (ontjom), peixe (katsuobushi) e mandioca (gari, kokonte, lafun) Alimentos e condimentos orientais e africanos Sacarose, polpa de beterraba e grãos de argila Cinética de processos

30 Produtos que podem ser obtidos por fermentação em estado sólido a partir de diferentes resíduos e fungos filamentosos PINTO, G.A.S. Produção de tanase por Aspergillus niger p. Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) - Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.

31 Exemplos de alimentos produzidos por fermentação em estado sólido
Produto Microorganismo Materiais Natto* Bacillus natto Soja Tempê* Rhizopus oligosporus Queijo Penicillium roqueforti Trigo Massa de pão Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus sanfrancisco Saquê Aspergillus oryzae, A. kawachii Arroz, cevada Missô* A. oryzae Soja, arroz Shoyu* A. sojae Soja, trigo *Especialidades da cozinha oriental

32 Substratos: características
O substrato (matriz sólida) deve ter algumas características que possibilitem o maior rendimento do processo. A principal peculiaridade é o alto grau de acessibilidade do microrganismo a todo o meio e, para tanto, as características mais importantes são: Porosidade: influência na capacidade de absorção de água, que facilita o transporte de enzimas e metabólitos por entre o meio e os microrganismos. Tamanho: este item é importante na definição da altura e granulometria do substrato. Granulometria própria visando permitir a circulação do ar por entre a massa e a dissipação dos gases e calor produzidos. Quanto menor o tamanho, maior a área superficial  maior o grau de transformação

33 Substratos: características – exemplos
Pandey et al. (1991) estudaram o efeito do tamanho da partícula do substrato na produção de enzimas em fermentação sólida. Utilizaram partículas de farinha de trigo e farinha de milho com diâmetros entre m e m, respectivamente. Resultaram em uma maior produção de amiloglicosidase. Embora notaram que partículas com diâmetro de 180 m e 1,4 mm apresentaram rendimentos similares. A figura abaixo apresenta a velocidade de fermentação, avaliada pela porcentagem de CO2 produzida no decorrer do processo, em função do tamanho das partículas do meio sólido. Observa-se que: tamanho das partículas maior a quantidade de gás carbônico produzido tempo em que o processo atinge o máximo de produção de CO2.

34 Substratos: preparo Boa parte dos substrato utilizados na fermentação em estado sólido necessitam de um pré-tratamento para se adequarem as condições necessárias de crescimento dos microrganismos e a produção dos metabólitos. Assim, para facilitar a atuação dos microrganismos sobre o meio, podem ser empregados os processos de: Esmagamento, quebra, moagem e peneiramento, visando adequar o meio à granulometria mais adequada do processo; Suplementação de nutrientes e correção do pH, para suprir a falta de algum nutriente ou adequar às melhores condições de crescimento microbiano; Hidrólise ácida ou alcalina de material celulósico, visando facilitar a atuação enzimática; Embebição: para regular o teor de umidade inicial; Vaporização ou aquecimento, visando a gelatinização ou inchamento do substrato; Adição de agente sequestrante, com o objetivo de retirar íons metálicos do meio, que podem diminuir o rendimento do processo; Processo de esterilização, que visa a diminuição ou eliminação de possíveis contaminantes.

35 Biorreatores para Fermentação Sólida
A forma empregada em praticamente todos os estudos diz respeito ao processo em batelada no qual o meio é adicionado ao reator, ocorrendo a inoculação do substrato e a incubação do mesmo por um determinado período de tempo. A seguir, o produto obtido pode ser extraído por suspensão do meio com água, soluções-tampão ou solventes (como no caso de enzimas, ácidos, álcool, etc.) ou simplesmente secado e armazenado (produção de bioinseticidas ou proteína microbiana). Outros modos de condução do processo são citados, tais como: Fermentação semicontínua na obtenção de ácido cítrico; Fermentação por batelada alimentada na obtenção de ácido giberélico; Fermentação contínua para a produção de enzimas fúngicas.

36 Biorreatores Reatores de vidro: utilizados em pesquisas laboratoriais.
Reatores de vidro: frasco de Fernbach, garrafa de cultura, tubular vertical, erlenmeyer de 250 mL e de 2800 mL. Os frascos de Fernbach e as garrafas de cultura são muito utilizados, inclusive a nível industrial na produção de esporos, devido a ampla área superficial entre o substrato e a atmosfera.

37 Biorreatores Bandejas: podem ter fundo inteiriço ou serem perfuradas. A disposição das bandejas deve ter local apropriado, podendo serem utilizadas salas com estantes e circulação de ar natural ou forçada, passando antes por umidificadores. Bandejas: com meio de cultura e vazia com fundo perfurado.

38 Biorreatores Tanques circulares: consiste de dois tanques rotatórios de 7 m de diâmetro, com um agitador helicoidal, dentro de uma câmara de condições controladas. Podem ser processados, a cada batelada, cerca de 2 a 3 toneladas de meio de cultura, com alimentação, esterilização, inoculação e retirada do produto realizados automaticamente (Toyama, N., 1976). Esteira rolante: este sistema é uma variante do fermentador de bandejas. As etapas de inoculação e incubação do material são realizadas em longas esteiras de fundo perfurado por onde circula o ar úmido.

39 Biorreatores Tubular horizontal (Tambor rotativo): o substrato é esterilizado e resfriado diretamente no tambor. A rotação do reator pode variar de 1 até 180 rpm. A agitação do substrato pode ser realizada pela simples rotação do reator ou por agitador central contendo número variável de pás (denominado fermentador tubular com agitação interna).

40 Biorreatores Tambor rotativo

41 Biorreatores Tubular vertical (fermentador tipo coluna): muito utilizado em pesquisas. Podem ser construídos de vidro ou aço inox, com dimensões de 2 a 40 cm de diâmetro por 20 a 180 cm de altura, permitindo uma capacidade entre 8 a 10 kg por batelada.