MANIPULAÇÃO DO DNA in vitro: DNA- recombinante e PCR

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1 MANIPULAÇÃO DO DNA in vitro: DNA- recombinante e PCR

2 CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Análise Molecular do DNA – somente possível fragmentando o DNA em pequenos tamanhos: através de endonucleases de restrição (enzimas bacterianas que clivam internamente o DNA) ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Tipo de nuclease que cliva uma cadeia dupla de DNA sempre que identificar uma sequência específica de 4 a 8 pares de bases, produzindo um grupo 3’- OH em uma extremidade e um grupo 5’- fosfato na outra. As sequências reconhecidas apresentam nas duas cadeias complementares sequências idênticas mas invertidas: PALÍNDROMO.

3 CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS
NOMENCLATURA DAS ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Denominação de acordo com o organismo da qual foi isolada. Primeira letra corresponde ao gênero do microrganismo. As duas letras seguintes referem-se a espécie e um número final indica a ordem da descoberta da enzima no organismo. Ex:. Hae III (3º ER isolada da bactéria Haemofilus aegyptius)

4 CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS

5 CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS
DNA LIGASE Enzima que promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição. O DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia.

6 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
HISTÓRIA Ferramenta que permite  amplificar uma seqüência específica de DNA (seq. alvo) em milhões de vezes dentro de poucas horas (Xerox) PCR  citada em mais de trabalhos científicos (08/2005)

7 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

8 1c 1a 2c 2a 3c 3a 4c 4a 5c 5a 6c 6a P P = padrão de tamanho molecular lambda Hind III Nc = controle sem DNA molde Ne = amostra com DNA molde – sem resultado positivo (molde?) Gel será refeito utilizando-se outros PCRs Bandas visíveis [Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio e fotografado sob luz UV] PCR

9 CROMATOGRAFIA POR SOUTHERN BLOT
2. HIBRIDIZAÇÃO DA SONDA A FRAGMENTOS DE DNA

10 ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DE DNA (RFLP)