Prof. Odir A. Dellagostin

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1 Prof. Odir A. Dellagostin
Biblioteca Genômica e de cDNA Prof. Odir A. Dellagostin

2 Biblioteca Genômica É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado organismo

3 Características das Bibliotecas de DNA
São usadas para principalmente para procariotos Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para estudo de regiões reguladoras Independe do típo de célula utilizada para a obtenção do DNA

4 Biblioteca de cDNA É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA. É usada principalmente para células eucarióticas. Varia de acordo com o tecido utilizado.

5 Etapas na construção de uma Biblioteca

6 Bacteriófagos Bacteriófagos

7 Cosmídios

8 Hibridização  Renaturação
HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens diferentes Hibridização  Renaturação

9 Aplicações Triagem de Bibliotecas Genômicas Diagnóstico molecular
Tipagem molecular Teste de paternidade Medicina forense

10 Triagem de uma biblioteca
Conhecer parte da seqüência do gene Seqüência completa do gene Sonda de DNA Utilizar sonda de oligonucleotídeos derivado de uma proteína Codon degenerado Conhecer cerca de 6 aa contíguos Anticorpos

11 1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos

12 Marcação da Sonda de DNA
- Seqüência de DNA Marcada Marcação da Sonda de DNA Radioativa: 32P Não radioativa: peroxidase, fosfatase alcalina

13 Sondas Covalentemente marcada com a enzima
Marcação da Sonda de DNA Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalina Desnaturação DNA DNA fita simples + peroxidase complexada com polimero positivo Ligação Fraca (DNA+ Peroxidase) + glutaraldeído Sondas Covalentemente marcada com a enzima

14 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização
Placas com Colônias contendo os plasmídeos 1 Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA 3 2 4 6 5 Sonda Filme de Raio - X

15 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização

16 Caracterização da seqüência encontrada
Seqüenciamento de DNA PCR Expressão da seqüência codificadora

17 Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western Blot - Proteína

18 Southern Blot Sonda: seqüência de DNA marcada
Transferência de DNA do gel para a membrana

19 NORTHERN BLOT 1. Extração do DNA 4. Geração de uma sonda marcada
3/26/2017 1. Extração do DNA 4. Geração de uma sonda marcada dATP dGTP dTTP dCTP pGEM-T 2. Eletroforese do RNA 5. Hibridização 6. Visualização Northern blotting allows easy and more or less quantitative detection of a limited number of transcripts. Total RNA (or mRNA) is separated on an agarose gel and transferred to a nylon membrane. This membrane is then incubated with a radiolabeled probe derived from the gene of interest. After hybridization, size and amount of the corresponding transcript in the RNA pool are revealed by autoradiography. The method is not very sensitive. 3. Transferência para a menbrana