Análise de Hibridização

Apresentação em tema: "Análise de Hibridização"— Transcrição da apresentação:

1 Análise de Hibridização
Caio Fagundes João Moreira

2 Breve histórico A idéia de imobilizar e hibridizar moléculas em um suporte sólido foi primeiro proposta por Denhardt (1966), conduzindo ao desenvolvimento de metodologias de identificação de seqüências no DNA genômico e de clonagem. O passo seguinte foi dado por Southern (1975), quando demonstrou como poderia ser feita a transferência de DNA do gel para membranas;

3 Segundo Dyson (1991), desde as descobertas de Denhardt e Southern as técnicas de hibridização em membranas tornaram-se gradativamente sofisticadas, principalmente devido a melhor compreensão acerca dos fatores que influenciam a taxa de hibridização e estabilidade dos híbridos.

4 Hibridização de ácidos nucléicos
É o pareamento complementar de bases entre os ácidos nucléicos de fita simples, gerando um produto dupla fita. Pode ser: DNA/DNA RNA/RNA DNA/RNA

5 Hibridização de ácidos nucléicos
Como se mantem unidas as fitas? Pontes de hidrogênio entre as bases; Interações hidrofóbicas entre as bases adjacentes de uma mesma fita.

6 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos
Número de pares GC v/s pares AT; Grau de complementariedade; Tamanho das fitas (número de pares de bases) ; Concentração de sal na solução; Temperatura; Concentração de formamida (para híbridos de RNA).

7 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos
Número de pares GC v/s pares AT: Maior número de ligações de H entre as fitas  maior estabilidade dos híbridos. 3 ligações de H entre G e C 2 ligações de H entre A e T

8 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos
Grau de complementariedade: Menor complementariedade de bases:  menos ligações de H formadas;  menor estabilidade.

9 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos
Tamanho das fitas: Maior tamanho (cDNAs >200pb):  mais ligações de H;  maior estabilidade do híbrido. Menor tamanho (oligos <50pb):  Maior especificidade;  Menor probalidade de hibridização cruzada.

10 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos
Concentração de sal na solução:  [sal]   estabilidade do híbrido Cátions monovalentes (Na+) ou divalentes (Mg++) As cargas negativas dos grupos fosfato repelem umas às outras. Os íons positivos da solução reduzem a repulsão eletrostática entre as fitas.

11 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos
Temperatura: Maior T  aumenta a energia cinética das fitas e desestabiliza a estructura dos ácidos nucléicos.  as fitas se separan.

12 Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos
pH:  [OH- ] ionização dos grupos fosfato, favorecendo a repulsão eletrostática entre as fitas. Concentração de formamida: Provavelmente forma ligações de H com os ácidos nucléicos; Desestabiliza a formação de híbridos.

13 O efeito combinado destes fatores pode ser expresso em uma equação para o cálculo da Tm
O que é Tm? Tm = temperatura de melting ou temperatura de separação das fitas. A Tm é uma medida de estabilidade dos híbridos, definida como a temperatura na qual 50% dos híbridos se encontram formados e 50% permanecen dissociados. 50% 5’ ’ 3’ ’ 5’ ’ 3’ ’ 50%

14 Tm = 81,5 ºC + 16,6log[Na] + 41(%G+C) - 0,63(%formamida) - (500/L)
Para DNA:DNA Tm = 81,5 ºC + 16,6log[Na] + 41(%G+C) - 0,63(%formamida) - (500/L) Para DNA:RNA Tm = 79,8 ºC + 18,5log[Na] + 58,4(%G+C) + 11,8(%G+C)2 - 0,5(%formamida) - (820/L) Para oligonucleotidos em 1 M Na+ Tm (oC) = 4 (G+C) + 2 (A+T)

15 Dot/Slot Blot Desenvolvido primeiramente por Kafatos et al em 1979.
Usado na determinação da abundância relativa de uma seqüência alvo em uma série de amostras de DNA Aplicada em análise genômica de espécies relacionadas Zoo Blot: blots contendo DNA de uma variedade de espécies relacionadas.

16 Dot/Slot Blot Técnica de imobilização de DNA não fracionado em uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Posteriormente a análise de hibridização pode ser feita. Dot ou Slot: Diferenças na geometria do blot

17 Dot/Slot Blot Dot/Slot blotting de DNA em membranas não carregadas de nitrocelulose e nylon: Aprelho de sucção e um manifold Materiais: SSC 6x e 20x DNA a ser analizado Solução de desnaturação: 1.5M NaCl/0.5M NaOH Solução de neutralização: 1M NaCl/0.5M tris.Cl pH 7,0 Membrana Folhas de papel de filtro Manifold Plástico transparente a luz UV Fonte UV

18 Dot/Slot Blot Embeber a membrana e o filtro de papel em SSC 6x por 10 min. Posicionar a membrana sobre o filtro no manifold. Observar se há bolhas de ar. Diluir DNA com água e SSC 20x p/ um volume de 400ul. Desnaturar o DNA em banho de água a 100 ºC por 10 min. Ligar o aparelho de sucção ao manifold, adicionar 500ul de SSC 20x e permitir filtragem (5 min). Centrifugar amostras de DNA e aplicar aos poços. Filtrar.

19 Dot/Slot Blot Após filtragem, colocar membrana sobre um papel de filtro embebido em solução de desnaturação por 10 minutos. Levar membrana a um papel embebido em solução de neutralização por 5 minutos. Embrulhar a membrana no plástico transperente a UV e posicioná-la com o DNA voltado para baixo na fonte de UV pelo tempo indicado. Secar a membrana.

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21 Análise de Hibridização
DNA de fita simples e RNA de sequencias definidas podem parear com um segundo DNA ou RNA com uma seqüência complementar, com a estabilidade do híbrido dependendo do grau de pareamento de bases. Experimentalmente usa-se uma sonda marcada e um DNA alvo imobilizado em uma membrana. É um método bastante sensível.

22 Análise de Hibridização
Imobilização; Adição das sondas na solução de hibridização; Lavagem: grau de complementaridade; Sondas: 100 a 1000 bp marcados radioativamente; Diversos protocolos: Southern e Dot

23 Análise de hibridização de DNA com sonda de DNA marcada
Bloqueio de sítios não específicos Incubação com a sonda. Lavagem. Materiais: Sonda Solução de pre-hibridização/hibridização 2x SSC/0,1% SDS, 0,2x SSC/0,1% SDS, 0,1x SSC/0,1% SDS, 2x e 6x SSC Incubadora Tubo de hibridização Reagentes para marcação de DNA e autoradiografia

24 Análise de hibridização de DNA com sonda de DNA marcada
Marcação da sonda de DNA (nick translation ou random priming) a atividade especifica de 1x108 dpm/ug; Molhar a membrana com o DNA em 6x SSC; Incubar membrana no tubo de hibridização com APH (1ml para 10cm2) por 3 hr a 68 ºC; Desnaturar sonda a 100 ºC por 10 min; Repor a APH contendo a sonda no tubo e incubar overnight a 68 ºC; Lavar a membrana (SSC/SDS - ciclos de 10 min); Fazer autoradiografia.

25 Análise de hibridização de DNA com sonda de RNA marcada
Construção de sondas de RNA (RNA pol:SP6, T3 ou T7) para o DNA template; Para marcação radioativa adicionar NTPs radioativos. Molhar a membrana com o DNA em 6x SSC; Incubar membrana no tubo de hibridização com FPH (1ml para 10cm2) por 3 hr a 42 ºC; Trocar o FPH, adicionar a sonda no tubo e incubar overnight a 42 ºC, sob agitação; Lavar a membrana (SSC/SDS - ciclos de 10 min).

26 Repor a solução de lavagem e adicionar igual volume de 2x SSC (25g/ml RNase A + 10U/ml RNase T1) e incubar 30 min; Realizar a autoradiografia. Para remover as sondas da membrana hibridizada basta realizar um tratamento com 0,4 M de NaOH à 45 ºC, ou com 0,1% de SDS. Assim a membrana poderá ser novamente hibridizada.

27 Random priming: Nick translation:
DESNATURACION ALINEAMIENTO DE PARTIDORES DNA POLIMERASA + dNTPs + dNTP-P ds DNA DNase I quebra o DNA DNA pol I agrega NTPs