Revisão Ácidos Nucleicos

Apresentação em tema: "Revisão Ácidos Nucleicos"— Transcrição da apresentação:

1 Revisão Ácidos Nucleicos
Antonio Figueira CENA

2 Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos
Papel de nucleotídeos no metabolismo celular: constituinte dos ácidos nucleicos - RNA e DNA fonte de energia no metabolismo -> ATP molécula-sinal em respostas celulares - > cAMP componente estrutural de enzimas e co-fatores -> NAD, FAD, etc

3 Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos
DNA: Armazenamento da informacão genética estabilidade RNA: várias funções RNA ribossomal (rRNA) - componentes estruturais de ribossomos RNA mensageiro (mRNA) - intermediário RNA transferência (tRNA) - moléculas adaptadoras que traduzem informação do mRNA em amino ácidos snRNA, microRNA, etc

4 Dogma Central

5 Ácidos Nucleicos RNA e DNA Unidades: Pentose (5 C)
Base nitrogenada – pirimidinas purinas Fosfato - C - 5’

6 Nucleotídeos Base nitrogenada + Pentose + Fosfato
Nucleosídeo = Base nitrogenada + Pentose

7 Pentoses Ribose em RNA 2’-deoxi-ribose em DNA b-furanose

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10 Nucleotídeos Base nitrogenadas Pirimidina: Timina, Uracil e Citosina
Purina: Adenina e Guanina

11 Ácidos Nucleicos Numeração: Pentose = Carbonos – 1’ a 5’
Base nitrogenada – pirimidinas = 1 a purinas = 1 a 9 Ligação pentose – pirimidina – C 1’ N pentose – purina – C 1’- N-9 Fosfato 5’: mono-, di-, tri- = fósforo a b g a = ligação éster (baixa energia) b g = ligação fosfoanidro (alta energia)

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13 Nucleotídeos Base Nucleosídeo Nucleotídeo
Adenina Adenosina Adenilato RNA Deoxiadenosina Deoxiadenilato DNA Guanina Guanosina Guanilato RNA Deoxiguanosina Deoxiguanilato DNA Citosina Citidina Citidilato RNA Deoxicitidina Deoxicitidilato DNA Timina Timidina Timidilato DNA Uracil Uridina Uridilato RNA

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16 Bases modificadas

17 Bases modificadas

18 Ligação Fosfodiester Polaridade 5’ -> 3’ pH 7 = fosfatos c/ carga negativa neutralizados por interações iônicas com ptn, ions, poliaminas

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21 Estrutura do DNA 2 cadeias independentes Dupla hélice, sentido direito
Hélices anti-paralelas Complementariedade das bases Eixo externo hidrofílico - deoxiribose + fosfato Bases hidrofóbicas (planas) no interior Bases ligadas pontes de H + empilhadas (stacking) Major groove e Minor groove (ondulação)

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24 Estrutura do DNA Bases hidrofóbicas, relativamente insolúveis em água pH neutro > solublidade em pH + ácido ou + básico interações hidrofóbicas por “empilhamento” (base stacking) - duas bases planas sobrepostas stacking função de força van der Waals e interação dipolo-dipolo entre bases minimiza contato com água

25 Estrutura do DNA Estabilidade da estrutura secundária:
Pontes de H – pareamento Watson e Crick função de forma tautômero – distância correta entre C-1’ -> A -T e G - C Interações hidrofóbicas Empilhamento (base stacking) = interação de nuvens de elétrons p Hidrofobicidade (cavitation energy) = quebra de pontes de H da água – força bases internamente

26 Estrutura do DNA Pareamento de bases crítico:
Biológico – replicação, transcrição, controle expressão gênica Análise – Hibridização, PCR, microarranjo, seqüenciamento

27 Propriedades de Nucleotídeos
moléculas altamente conjugadas afetando estrutura, distribuição de elétrons e absorção de luz UV moléculas planas (pirimidina) ou quase (purina) absorbância máxima - cerca 260 nm

28 Espectro de absorbância de nucleotídeos

29 Química de Ácidos Nucleicos
Estabilidade do DNA - depósito genético! Propriedades Desnaturação = separação da dupla fita quebra das pontes de H causado por calor ou pH (e proteínas in vivo) Renaturação ou anelamento decréscimo da temperatura ou pH Alteração na Absorbância (UV) Abs 260 nm hipocromicidade: renaturação hipercromicidade: desnaturação

30 Desnaturação e renaturação do DNA
Calor – melting pH extremos – DNA em pH 12 Ácido - hidrolisa DNA e RNA Base – hidrolisa RNA Processo de desnaturação altera Absorbância Perda de stacking – aumenta Abs 260 nm DNA fita simples – hidroxiapatita e S1 nuclease Alteração Hipercrômica – aprox. 30% maior

31 Cinética de Renaturação
1. Solução de DNA aquecida lentamente 2. Medir Abs260nm 3. Gráfico Abs x Temperatura 4. DNA desnatura em faixa estreita de ToC de forma cooperativa = Tm Tm = temp. 50% DNA desnaturado Tm = função de [sais] Conceito usado em sondas e primers (estringência) DNA RNA

32 Cinética de Renaturação
Renaturação não apenas reverso de desnaturação! ocorre naturalmente 5 – 10oC abaixo Tm Renaturação = função de [DNA] – freqüência de bases complementares se encontrarem Depende de complexidade do genoma Genoma – não retorna a Abs260nm original Genoma fragmentado – renatura completamente Renaturação = função tamanho e complexidade do genoma Afetado concentração de sais e temperatura

33 Curvas CoT C/Co = 1/(1 + kCoT) Taxa de Renaturação
Função do tamanho do genoma Genoma menor renatura mais rapidamente Curvas CoT C/Co = 1/(1 + kCoT) C = [ssDNA] Co = [DNA] K = constante da taxa de reassociação T = tempo

34 Cinética de Renaturação
Temperatura de desnaturação = Tm Função: composição G+C Permite estimar tamanho de genoma (CoT)1/2 Complexidade do Genoma soma dos comprimentos das seqüências únicas mais as unidades de comprimento de cada família de seqüências repetitivas Seqüências únicas – componente cinético único > componente cinéticos genoma complexo

35 Curva Cot Cebola Fold-back Highly Repetitive Medium Repetitive
Single/Low copy

36 Cinética de Renaturação
Complexidade de Seqüência: grupo mínimo (em pb) que define o genoma; Valor Cot: definido como o produto da concentração de nucleotídeos em moles por Litro (Co) e seu tempo de renaturação (t); Componente Cinético: grupo de seqüências genômicas que exibem propriedades de renaturação similares, e consequentemente aparecem como região sigmoidal distinta na curva Cot.

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38 Número de clones necessários para 99% certeza que todas as
seqüências estão presentes Z = tamanho médio inserto (pb) G = tamanho 1 C do genoma (pb) Número de clones necessários para 99% certeza que todas as seqüências estão presentes considerando as frações de componentes cinéticos (a, b, c e f)

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40 Artigos publicados sobre cinética de reassociação

41 RNA 1961 - Jacob & Monod -> RNA intermediário mRNA rRNA tRNA
RNAs ocorrem no núcleo e citoplasma mRNA monocistrônico - eucariotos policistrônico - procariotos rRNA tRNA

42 rRNA em Ribossomo tRNA

43 Hidrólise espontânea de RNA em condições alcalinas

44 Estrutura de RNA mRNA -> fita simples rRNA tRNA
tendem a assumir conformação helicoidal direita dominada pelo emplihamento das bases (pur-pur) auto-complementariedade - estrutura mais complexas pareamento: A-U, G-C e G-U! estrutura 3ária função de seqüência (~ a ptn) interações com grupo OH de C-2’ formas A e Z, mas não ocorre forma B! rRNA tRNA

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48 Química de Ácidos Nucleicos
Transformações não -enzimáticas desaminação - perda de grupo amina alterações espontâneas, baixíssima taxa perda de amina por C -> U - reconhecido em DNA taxa h-1 DNA - possui T ao invés de U!

49 Química de Ácidos Nucleicos
Transformações não -enzimáticas hidrólise da ligação N-b-glicosidil entre base e pentose ou Depurinação ocorre mais para purinas acelerado em meio ácido

50 Química de Ácidos Nucleicos
Transformações não -enzimáticas radiação UV condensação de 2 etilenos em ciclobutano DNA - 2 pirimidinas (T) adjacentes -> dímeros agentes ambientais deaminanntes alquilantes

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