EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi

Apresentação em tema: "EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi"— Transcrição da apresentação:

1 EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi
Depto. De Biologia Molecular Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo 07/06/2013

2 Porcentagem de Descarte Sorológico na FPS/HSP
1991Int.: ALT, HCV, HTLV; Int. ELISA Sífilis; Ret. Fix Complemento; Int. HBc e Informatica; 2001 Ret. HA Chagas; Ret. VDRL; 2004 Ret. ALT e IFI Chagas; Int. HIV Combo; Int. HCV Combo; 2011 Int. NAT HIV/HCV

3 Porcentagem de Descarte - HIV
Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) CMIA - Ag + Ac – Architect Abbott ( - 10%) Obs.: 2004 ELISA Ag + Ac 2011 NAT

4 Porcentagem de Descarte - HCV
Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) Obs.: 2008 ELISA Ag + Ac 2011 NAT

5 FPS 2010 ANTI-HCV= 0.32% ANTI-HIV= 0.18%

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8 Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1
RNA plasmático DT = 21.5 hrs Anticorpos anti-HIV 1nd gen 2nd gen Antígeno p24 3rd gen “blip” viremia 11 16 22 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia 22

9 11.3/MILHÃO = 1:88.500

10 “Eu penso que doar sangue é uma maneira boa, rápida e anônima de ter um teste de sangue”
“Eu doo sangue para ter meus resultados” Entre 3061 participantes, 208 (7%) se encixaram na definição de “buscadores de teste”!

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15 Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1
RNA plasmático DT = 21.5 hrs Anticorpos anti-HIV 1nd gen 2nd gen Antígeno p24 3rd gen “blip” viremia 11 16 22 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia 22

16 Teste de Ácido Nucléico (NAT) Portarias do Brasil
Port. 262 M.S. 02/ introdução do NAT em 6 meses: 1 laboratório por estado “pool” de 8 amostras Port M.S. 08/2002 – adiada por 6 meses: Alto custo do teste. Incapacidade de organizar todos laboratórios Port / adiada por 1 ano Port / Dispõe sobre a implantação, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e HCV. Art. 1º Determinar a implantação, em etapas, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e de detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e para HCV, nas amostras de sangue de doadores.

17 Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos
Plataforma multiplex para HCV e HIV; Pool de 6 amostras; estudos-piloto - SC Estudos multicêntricos (outros hemocentros brasileiros: SC, PE, RJ e SP) para aprovação, validação e logística. Registro em 12/2010 01/05/2011 – Início oficial nos hemocentros de SC, PE, RJ e SP 14 Sítio Testadores (tds iniciaram falta BA). 17

18 blood units/day (based on the # of serology tests) 30 ¬ 100 100 ¬ 200 200 ¬ 400 400 ¬ 800 800 ¬ 1000 1000 ¬ 1500 1500 ¬ 2000  Belém, 349  Manaus, 376 Fortaleza, 646   Recife, 942  Salvador, 438 Brasília, 773   B.Horizonte,  1192 Campo Grande,  São Paulo 1923   Rio de Janeiro, 1083 Curitiba, 769  Florianópolis, 1115 BUT … São Paulo State – due to size and complexity … will be addressed further ! How to? Choice of Blood Center Labs where NAT will be installed – Centralized system based on: Easiness for primary tube logistics and report return within platelet saving time (<24h) Throughput capacity and infra-structure of labs from Main Blood Centers within each micro-region already established for serology tests.

19 Manual Operacional NAT
Sítio Testador (SIT) 24 horas para resultado após o recebimento Encaminhar tubo para coleta Relatórios CGSH e Bio-Manguinhos Unidade Referenciadora de Amostra (URA) - encaminhar amostra, soroteca e da sorologia Relatório para o SIT Distribuição dos tubos para UCA Coleta e centrifuga amostra Conservar em geladeira Unidade Coletora de Amostra (UCA) Relatório para a URA

20 Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos
Extração – 2h e 30min Pooling – 2h 30 min - 20ºC 30 min + 22ºC Amplificação–3h PCR Setup –30min Tempo total 9h

21 NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste
Tubo primário - PPT Pool – 6 amostras Plataforma automática Janus Perkin Elmer

22 Protocolo de rotina TOTAL POOL SINGLE 1 552 2 522 516 6 3 492 480 12 4
2 522 516 6 3 492 480 12 4 462 444 18 5 432 408 24 402 372 30 7 336 36 8 342 300 42 9 312 264 48 10 92

23 NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste
Adição da partícula calibradora Extração – Biorobô MDx (T. lise e protease, temp 65ºC) Amplificação + Detecção (HIV, HCV part calibradora) – PCR tempo real Applied Biosystems 7300

24 NAT FPS Total doações

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29 Amostra Janela HIV – Retrovigilância (Soroteca)
- Processada dia 17 de março de 2011 Amostra em SINGLE Ct: 32,54

30 Total de doações = 379.422 (FPS+HS)
HCV Maio de 2011 a Abril de 2013 Total de doações = (FPS+HS) Total de resultados reagentes: 1052 Prevalência = 0.05% EIA Ac/Ag Reagente Não Reagente NAT Detectável 192 7 (falso positivos NAT) NAT Não Detectável 853 Negativo

31 Total de doações = 379.422 (FPS+HS)
HIV Maio de 2011 a Abril de 2013 Total de doações = (FPS+HS) Total de resultados reagentes 1065 Prevalência = 0.04% Ac/Ag 2 testes EIA + CMIA Reagente Não Reagente NAT Detectável 163 28 (falso positivo NAT) 1 janela em abril de 2013 NAT Não Detectável 1065

32 HIV 28 amostras não são Janela Imunológica – falso positivo do NAT
PF coleta amostra bolsa CT retorno EIA WB NAT 03/12/2010 54 11/01/2011 N NR 11/02/2011 194828 09/12/2010 56 11/12/2010 44 31/12/2010 05/02/2011 13/12/2010 58 24/02/2011 15/12/2010 45 22/12/2010 16 01/03/2011 495641 48 13/12/2011 21/12/2010 02/01/2011 04/02/2012 13/01/2011 57 15/02/2011 14/01/2011 15 19/01/2011 35 24/01/2011 15/03/2011 46 02/03/2012 26/01/2011 51 02/03/2011 28/01/2011 23/02/2011 18/04/2011 21/02/2011 59 24/03/2011 15/04/201 20/03/2011 49 13/04/2011 06/05/2011 09/04/2011 24/41/ND 09/05/2011 22/06/2011 17/53/ND 27/07/2011 04/07/2011 16/11/2011 07/07/2011 50/52/ND 10/08/2011 11/07/2011 51/54/ND 20/07/2011 47/55/ND 31/08/2011 17/09/2011 59/50/ND 19/10/2011 29/09/2011 57/47/ND 21/10/2011 118057 30/09/2011 53/59/ND 08/02/2012

33 Última Doação Negativa: 02/08/2011
matriz capsídeo gp41 gp120 envelope CD4 CCR5 CXCR4 transcriptase reversa RNA viral SOROCONVERSÃO - HIV Doador: esporádico – 11 doações na FPS/HSP Última Doação Negativa: 02/08/2011 Sexo: masculino Idade: 36 anos gp120 gp160 p17 p24 Banda controle 16/04/13 03/05/13 14/05/13 Quimio (S/CO) NR 571,990 8,470 ELISA (DO) 3,000 2,784 NAT (CT) 32,0 17,856 22,848 W. BLOT - IND POS Teste de Western Blot: MP Diagnostics: HIV BLOT 2.2 Testes : Abbott: HIV Ag/Ac COMBO Quimioluminescencia BioRad: Genscreen “ULTRA HIV Ag-Ab (ELISA)”

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35 Teste NAT - 17/04/2013 Pool de 6 amostras - CT: 34,6374

36 Teste NAT - 18/04/2013 Amostra única - CT: 32,8703

37 Teste NAT - 03/05/2013 Amostra única – CT: 17,856

38 Teste NAT - 17/05/2013 Amostra única – CT: 22,848

39 RENDIMENTO PROJETADO PARA HIV WP
NAT – MP NA FPS = 4.2/MILHÃO = 1: OBSERVADO = 1:

40 RENDIMENTO NAT NO BRASIL
N AMOSTRAS CASOS WP TAXA HCV 4 1: HIV 5 1: LEVI ET AL., HEMO 2011

41 RISCO HIV –TX PRÉ-NAT MP NA FPS = 1:88.500
RISCO HIV –TX PÓS-NAT MP NA FPS = 1:

42 HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E
HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Receptor – Em Novembro 2011 apresentou sorologia e NAT + para HIV Em Julho 2011 a sorologia anti-HIV era negativa. Entre Agosto e Novembro Recebeu 47 transfusões com unidades da FPS. Todas as doações correspondentes foram re-testadas com NAT individual, sendo todas negativas. Os doadores foram reconvocados, 37 compareceram. Um doador apresentou soroconversão para HIV e NAT+.

43 HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E
HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Doador, Homem, 22 anos, 3ª doação espontânea na FPS DATA ANTI-HIV NAT CARGA VIRAL 28/09/2012 NEG INDETECTÁVEL 17/12/2012 POS 39,658 cps/mL

44 HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E
HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camola M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr.Transfusion, 2013, in press Número de réplicas Cobas MPX N+ Procleix Bio-Manguinhos Pura 20 3 13 Diluida 1:6 5 1 Plasma Negativo CARGA VIRAL ESTIMADA POR PROBIT ANALYSIS Entre 3.7 – 7.5 UI/mL

45 Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1
RNA plasmático DT = 21.5 hrs Anticorpos anti-HIV “blip” viremia 1nd gen 2nd gen Infecção Antígeno p24 3rd gen 11 16 22 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia 22

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