Produção de proteínas em bactérias

Apresentação em tema: "Produção de proteínas em bactérias"— Transcrição da apresentação:

1 Produção de proteínas em bactérias
3/25/2017 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II Produção de proteínas em bactérias Prof. Fabricio Rochedo Conceição 06 de abril de 2010 1

2 Proteína recombinante
DNA recombinante Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes. Proteína recombinante Proteína produzida a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.

3 Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?
Estudos bioquímicos Determinação da estrutura 3D Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico... Alternativa para as seguintes limitações: Quantidade Dificuldade de purificação a partir do tecido original Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

4 Pneumonia Micoplásmica Suína
Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

5 Sistemas de expressão heteróloga
***Animais e plantas

6 Produção de proteínas recombinantes em bactérias
Escherichia coli Bacillus subtilis Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!

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8 Engenharia genética X expressão heteróloga
1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparo do vetor 3. Ligação do vetor com o “inserto” 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

9 Vetores de Expressão Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG Sítio de múltipla clonagem (polylinker) Promotores induzíveis (controle da expressão) Sinais de secreção Fusão com proteínas carreadoras (solubilidade e purificação)

10 Vetor de expressão em E. coli RBS ou sequência de Shine Dalgarno

11 Regulação da expressão gênica – controle da expressão
Operon Lac

12 Vetores da família pET (Novagen)
Altos níveis de expressão Promotor T7 é mais forte que o lac Controle rigoroso pelo lacO Necessita de cepa de E. coli especial – BL21(DE3) IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)

13 Proteína recombinante de 70 kDa
Extrato total proteico de bactérias separado em SDS-PAGE não induzidas Proteína recombinante de 70 kDa induzidas com IPTG

14 Produção de proteínas recombinantes em bactérias
(sistema pET)

15 Vetor de expressão com cauda de histidina

16 Cromatografia de afinidade – Ni-Sepharose
Purificação de proteínas com cauda de histidina (his-tag)

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18 Minimizar a proteólise
Maximizar a expressão Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas) Facilitar o folding Solubilidade

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20 Algumas companhias que comercializam vetores de expressão

21 Produção de insulina recombinante
(Humulin: Human insulin da Eli Lilley Corporation) Primeiro hormônio recombinante disponível comercialmente para humanos; Antes de ser disponibilizada comercialmente era extraída de pâncreas de animais; Atualmente a forma recombinante é a mais usada no tratamento do diabetes. Estrutura e biossíntese da molécula de insulina humana Seq sinal Cadeia β Peptídeo C Cadeia α Preproinsulina Clivagem da sequência sinal de secreção Cadeia α Cadeia β Peptídeo C Cadeia α Ligações dissulfeto Proinsulina Cadeia β Clivagem do peptídeo C Insulina funcinal

22 Obtenção de insulina recombinante

23 Algumas proteínas recombinantes disponíveis
para terapia humana Insulina (rhI); Hormônio do crescimento (rhGH); Hormônio folículo estimulante (rhFSH); Fator VIII (rhFactorVIII); Eritropoetina (EPO); Fator estimulante de colônias de granulócitos (rhG-CSF); N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (rhASB); DNAse Ativador do plasminogênio tecidual (rhTPA); Glicocerebrosidase (rhGBA); Interferon-alfa, -beta e gama (rhIFN-alpha, -beta e -gama); Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1).

24 Vantagens e desvantagens do sistema de expressão heteróloga em E. coli
Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveis Atividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

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26 Trabalho complementar
* Formar grupos com 4 componentes * Buscar no PubMed artigo científico relacionado a expressão de proteína heteróloga em E. coli * Entregar até Referência bibliográfica Descrição da proteína recombinante Aplicação da proteína recombinante Vetor utilizado para a expressão Características do vetor de expressão Estratégia de purificação da proteína recombinante Resultados relacionados a expressão da proteína recombinante