Ácido desoxirribo-nuclêico Processo não comprovado

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1 Ácido desoxirribo-nuclêico Processo não comprovado
Biossíntese de proteínas Sede da informação A biossíntese de proteínas insere-se no dogma central da biologia molecular Ácido desoxirribo-nuclêico Processo comprovado Ácido ribonuclêico Processo não comprovado

2 Estrutura dos ácidos nuclêicos
Há dois tipos: ácido ribonuclêico (RNA), formado por ribonucleotídeos Ácido desoxirribonuclêico (DNA), formado por desoxirribonucleotídeos

3 Estrutura das cinco bases encontradas nos ácidos nuclêicos, com abreviaturas e nomencla-tura

4 Estrutura básica dos ácidos nuclêicos
Ao lado a estrutura do ribonucleotídeo Adenil-3',5'-uridil-3',5'-citidil-3',5'-guanilil-3'-fosfato Esta sequência pode ser abreviada: pUpCpGp ou apenas AUCGp O correspondente desoxirribonucleotídeo seria: d(ATCGp) A representação abaixo é esquemática; para representar um desoxirribonucleotídeo basta omitir os grupos 2'-OH

5 O modelo de Watson-Crick para o DNA
O DNA apresenta estrutura em dupla fita, com pareamento obrigatório: A sempre com T C sempre com G O pareamento é antiparalelo Os pares de bases de Watson-Crick A existência de sulcos diferentes (maior e menor) se deve: (1) Às diferentes estruturas das bordas superior e inferior das bases (2) À assimetria dos resíduos de desoxirribose

6 Atenção para os sulcos maior e menor ao longo da hélice
Watson e Crick também propuseram uma disposição em hélice (parafuso) das duas fitas complementares A estrutura ao lado corresponde ao que hoje se chama de hélice B do dodecâmero auto-complementar d(CGCGAATTCGCG) Atenção para os sulcos maior e menor ao longo da hélice

7 Somente as bases dos pares de Watson-Crick tem alta afinidade mútua; isto foi demonstrado em experimentos como os que estão ilustrados abaixo:

8 Em termos quantitativos:
B1 + B B11B2 Os valores de K quando B1 e B2 são A-U ou C-G são altos; mas, são baixos quando se trata de A-A, C-C, U-U, A-C, etc. O pareamento entre as bases de duas cadeias diferentes (fitas) é a regra no DNA O RNA em geral se apresenta como uma fita única que pode apresentar diveras regiões com pareamento intracadeia de acordo com as mesmas regras, i.e., A-U e G-C Pareamento intracadeia também pode surgir no DNA em consequência de certas manipulações

9 Este processo é similar ao que ocorre com as proteínas
A temperatura na qual 50% do DNA se apresenta na forma desnaturada recebe a denominação de Tm Quando o DNA desnaturado pelo calor é resfriado lentamente ele costuma readquirir sua configuração nativa, i.e., dupla hélice com pareamento intermolecular Se o resfriamento for crusco, o pareamento é imperfeito, parte intermolecular e parte intramolecular O desnaturamento do DNA implica na perda da estrutura da dupla hélice e na separação das cadeias que adquirem uma configuração randômica Este processo é similar ao que ocorre com as proteínas O desnaturamento do DNA ou RNA pelo calor costuma ser chamado de "fusão"

10 O efeito hipercrômico é utilizado para medir espectrofotometricamente a "fusão" do DNA
Há uma relação linear entre o valor de Tm e o teor em guanina + citosina no DNA

11 Por quê o DNA contém timina e o RNA uracila?
A citosina no DNA desamina espontaneamente originando uracila Esta reação é potencialmente mutagênica porque a citosina pareia com a guanina, mas a uracila com a adenina Na hora da replicação ou transcrição, ocorreria um erro! Para evitar o erro, existe um sistema de reparo, que substitui a uracila por uma citosina (uracil DNA-glicosidase) O grupo metila que distingue a timina da uracila é um sinal de reconhecimento; sem este sinal seria impossível distinguir a uracila corretamente presente da uracila resultante da desaminação da citosina.

12 Ao contrário do DNA, o RNA pode
hidrolisado por base A hidrólise básica depende de uma desprotonização do grupo 2'-OH da ribose, com formação de um composto cíclico intermediário A falta da hidroxila 2' na deoxirribose torna o DNA muito mais resistente à hidrólise em meio aquoso Este é o provável motivo pelo qual o DNA e não o RNA evoluiu como arquivo genético celular

13 Muitos DNA's contém bases
modificadas quimicamente A modificação mais comum é a metilação Também o RNA tem muitas bases modificadas As bases modificadas pareiam da mesma forma que as bases originais

14 Número de pares de bases (kb)
As moléculas de ácidos nuclêicos, principalmente DNA, podem ser muito longas! Organismo Número de pares de bases (kb) Contorno (m) Virus: Polioma, V Bacteriófago  Bacteriófagos T2, T4, T6 , , , Bactérias: Mycoplasma hominis Eschericchia coli Eucariotos (em número haplóide de cromossomos): Levedura Drosófila Humanos Peixe pulmonado

15 Autorradiografia de uma molécula de DNA de Drosophila melanogaster
A imagem foi obtida de células cultivadas na presença de timidina triciada

16 DNA-B É a forma mais comum de DNA A hélice é dextrógira
Inclinação dos pares de bases em relação ao plano perpendicular ao eixo: 1o Progressão por par de bases: 3.4 Å Vista transversal Os oxigênios dos anéis de desoxirribose estão em vermelho O par de bases mais próximo está em branco

17 DNA-A No DNA-A o C3 da desoxirribose está fora do plano
A hélice é dextrógira Inclinação dos pares de bases em relação ao plano perpendicular ao eixo: 19o Progressão por par de bases: 2.3 Å Ocorrência: formas bifilamentares do RNA e nos híbridos DNA-RNA Vista transversal No DNA-A o C3 da desoxirribose está fora do plano No DNA-B o C2 está fora do plano

18 DNA-Z Vista transversal
A hélice é sinistrógira Progressão por par de bases: 3.8 Å A forma B se transforma em Z quando as bases sofrem uma rotação de 180o Vista transversal Os oxigênios dos anéis de desoxirribose estão em vermelho O par de bases mais próximo está em branco

19 A replicação do DNA é semi-conservativa

20 A replicação semi-conserva-tiva foi provada em experimentos nos quais o DNA de Eschericchia coli foi inicial-mente marcado com 15N, mais pesado; nas gerações sucessoras, cultivadas sem 15N, formaram-se DNAs híbri-dos, que não se formariam se a replicação não fosse semi-conservativa

21 O DNA é replicado por enzimas chamadas DNA polimerases
Todas as DNA polimerases operam na direção '  3' a partir de um molde antiparalelo

22 A replicação semi-conservativa se dá a partir de forquilhas de replicação
Auto-radiografias obtidas com [3H]timidina revelam a estrutura  (olho de replicação) Diferenciação auto-radiográfica da replicação unidirecional e bidirecional do DNA Após marcação fraca com [3H]timidina, uma suspensão de E. coli recebe um pulso de grande quantidade de [3H]timidina. Alguns segundos após isola-se o DNA para fazer autorradiografia. Espera-se padrões diferentes para cada tipo de replicação

23 Todas as DNA polimerases conhecidas são capazes de estender fitas de DNA apenas na direção 5' 3'
Como, então, se dá a síntese na direção 3' 5' da forquilha de replicação? O que ocorre é uma replicação descontínua numa direção e contínua na outra; os fragmentos (de Okasaki) são unidos mais tarde por uma ligase

24 Como, então, se inicia a síntese de DNA?
Todas as DNA polimerases precisam de um grupo 3'-OH para estender a cadeia de DNA Como, então, se inicia a síntese de DNA? Uma enzima chamada primase (insensível à rifampicina) sintetiza um PRIMER de RNA tanto na fita lider como nos fragmentos de Okasaki Uma RNA polimerase pode sintetizar também um primer da fita líder

25 As três regiões de 13 pb ricas em A-T são então "fundidas"
Provável sequência de eventos durante a iniciação da replica-ção em E. coli na região oriC Os tetrâmeros da proteína DnaA ligam a cada um dos 9 pb repetidos no oriC Moléculas adicionais de DnaA ligam para formar uma espécie de nucleossomo As três regiões de 13 pb ricas em A-T são então "fundidas" A proteína DnaB separa-se do complexo DnaB-DnaC e entra na região em fusão e a atividade helicase da DnaB mantém a conformação randômica A proteína SSB liga para estabilizar as fitas separadas

26 Represen-tação do conjunto replissomo em cada forquilha de replicação

27 O que é, então, necessário para replicar o DNA? PROTEÍNA FUNÇÃO
DNA girase Desespiraliza o DNA SSB Ligação e estabilização da fita simples do DNA DnaA Fator de iniciação HU Ligação e estabilização do DNA (semelhante a histonas) PriA Montagem do primosso, 3'5' helicase PriB Montagem do primossomo PriC Montagem do primossomo DnaB 3'5' helicase (desespiraliza o DNA) DnaC Chaperona DnaB DnaT Auxilia o DnaC na liberação do DnaB Primase (iniciase) Síntese do primer de RNA DNA polimerase III Elongação (síntese propriamente dita do DNA) DNA polimerase I Elimina o primer de RNA, preenchendo com DNA DNA ligase Liga covalentemente os fragmentos de Okazaki Ter Término

28 A transcrição é feita por uma RNA polimerase usando o DNA como molde
DNA-polimerases dirigidas por RNA ocorrem em vírus (transcriptase reversa) RNA-polimerases dirigidas por RNA ocorrem em vírus e plantas

29 Forma ligações fosfodiester Reconhece o promotor e inicia a síntese
RNA polimerase A enzima de E. coli é complexa (450 kd) SUB-UNIDADE NÚMERO MASSA (kd) FUNÇÃO  2 37 Incerta  1 151 Forma ligações fosfodiester ' 155 Liga o molde de DNA  50 Reconhece o promotor e inicia a síntese Ela executa várias funções: 1. Procura por sítios de iniciação (sítios promotores) no DNA 2. Desespiraliza um curto trecho da dupla hélice do DNA para liberar um molde de fita única 3. Seleciona o ribonucleosídeo fosfato correto e catalisa a formação de uma ligação fosfodiester; este processo é repetido muitas vezes à medida que a enzima se move ao longo do DNA 4. Detecta sinais de terminação 5. Interage com ativadores e repressores que modulam a velocidade da transcrição