A Genética Molecular em Análises Clínicas

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1 A Genética Molecular em Análises Clínicas
2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

2 A Genética Molecular em Análises Clínicas
Preparação de Ácidos Nucleicos 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

3 Preparação das células: pulverização pós congelação

4 Preparação das células: homogeneização

5 Preparação das células do sangue: Centrifugação em gradiente descontínuo de densidade (Ficoll)

6 Preparação das células do sangue: Lise dos eritrócitos

7 PREPARAÇÃO DE DNA E RNA DNA e RNA de mamiferos:
Lise suave e solubilização do DNA/RNA Destruição enzimática das proteínas (proteases) Destrição e precipitação quimica das proteínas (fenol/clorofómio/ácido isoamilico) Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio) Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia remoção de sais)

8 Método do fenol/ clorofórmio

9 Método do salting-out

10 PREPARAÇÃO DE DNA E RNA DNA e RNA bacteriano
Como a dos mamíferos, mas é necessário ser eficaz na separação de polissacáridos, muito abundantes em algumas bactérias: CsCl Enzimas: Lisozima Lisostafina etc

11 Ultracentrifugação em gradiente de densidade (CsCl)

12 Separação de ácidos nucleicos por cromatografia de troca iónica

13 Eluição dos vários ácidos nucleicos em função do pH

14 Colunas de sílica (ex. Qiagen)

15 Formato de 96 poços

16 DNA Genómico

17 Vacuo Versus Centrifugação

18 Qiagen Biorobot 9600

19 Qiagen Biorobot 9604

20 Método de Boom Sample + Lysis buffer GuSCN Nucleic acid Wash
Silica Wash Proteins and Lipids Elution buffer processing time 10 samples/1.5h Centrifugation Purified Nucleic acid

21 “Boom” compatible Sample Types
Full Blood Serum/plasma PBMC/PBL Sputum Urine Brain tissue Spleen tissue Liver tissue Faeces Throat swabs Dermal lesions swabs Cerebro spinal fluids Cervical smears Pus samples Foodmatrices Ref. Boom et al. J. Clin. Microbiol. (28), , 1990

22 Nuclisens Extractor

23 Unidade Principal

24 Baía dos reagentes

25 Cartridge modules

26 As cartridges

27 MagnaPure (Roche)

28 MagnaLyser

29 Outros sistemas automáticos