Validação de Métodos Bioanalíticos para Estudos em Humanos

Apresentação em tema: "Validação de Métodos Bioanalíticos para Estudos em Humanos"— Transcrição da apresentação:

1 Validação de Métodos Bioanalíticos para Estudos em Humanos

2 Sumário Introdução Padrões Pré-Estudo Estudo Documentação

3 Introdução Estudos Aplicáveis: Não Aplicáveis: Farmacologia Clínica
Biodisponibilidade Bioequivalência Não Aplicáveis: Toxicológicos ou Farmacológicos em animais. Dissociação in vitro.

4 Metodologias Matrizes Biológicas
Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC) Cromatografia Gasosa (GC) Métodos Imunológicos e Microbiológicos Matrizes Biológicas Sangue, Soro, Plasma, Urina e Outros (Ex: Pele).

5 HPLC-MS/MS

6 Padrões Análise de Drogas ou seus Metabólitos é invariávelmete feita através de amostras “contaminadas”, curvas de calibração e amostras de controle de qualidade (QC). Padrões de Referência autenticados devem ser utilizados no estudo. Preferivelmente o mesmo composto. Caso contrário um sal, base, ácido ou éster do composto pode ser usado.

7 Escolha da Procedência:
Padrões certificados (U.S.Pharmacopea) Padrões disponíveis comercialmente de fontes de conhecida reputação. Padrões com pureza documentada, específicamente sintetízados por laboratórios comerciais.

8

9 Pré-Estudo Objetivo: Avaliar os parâmetros de desempenho do método.
Deve ser documentado e conter o desenvolvimento do método. Deve ser realizado para cada matriz biológica e cada espécie química estudada.

10 Pré-Estudos de validação de um método analítico deve ser realizado com pelo menos 3 lotes da matriz biológica, onde cada lote é coletado de uma fonte diferente. Cada lote deve conter: (1) uma curva de calibração utilizando a matriz pura, matriz + I.S. e 5 a 8 pontos com a faixa de aplicação do método. (2) Amostras de Controle (n  5) de Qualidade de Baixa concentração (QCA) Média concentração e (QCB) Alta concentração (QCC) e Limite de Detecção (LOQ QC).

11 Parâmetros de Desempenho
Especificidade Linearidade - Curva de Calibração Exatidão, Precisão e Recuperação Controles de Qualidade (QCs) Estabilidade

12 Especificidade Especificidade é a capacidade do método analítico em diferenciar e quantificar o analíto na presença de outros constituintes da amostra e refere-se diretamente a capaciadade do método em produzir resposta frente a um único analíto. (Karnes, 1991)

13 Análise da matriz biológica de 6 indivíduos são realizadas sob condições controladas, avaliando-se o horário da coleta, ingestão de alimentos, e outros fatores considerados importantes ao método. Cada “branco” deve ser avaliado em relação a interferentes, utilizando-se o método de extração proposto e as condições analíticas em questão (HPLC, LC/MS/MS).

14 Os resultados são confrontados com os obtidos de uma solução aquosa do analíto em concentrações próximas ao Limite de Quantificação (LOQ). Qualquer interferência significativa no tempo de retenção da droga, do metabólitos ou do padrão interno (I.S.) deve ser rejeitado. Interferência em mais que 10% o método deve ser alterado para eliminar os interferentes.

15 Interferentes na matriz biológica incluem: componentes endógenos, metabólitos, produtos de decomposição e medicação concomitante. Nicotina, drogas OTC e seus metabólitos, como cafeína, aspirina, acetoaminofen e ibuprofeno devem ser testados. Se mais de um analíto é avaliado, cada um deve ser injetado separadamente.

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17 Blank Sample I.S. 21-OH DFZ 21-OH DFZ (1ng/mL) + I.S. I.S. 21-OH DFZ

18 Linearidade: Curva de Calibração

19 O Padrão Interno (I.S.) tem como finalidade corrigir erros e\ou perdas
2 1 - H y d r o x D F Z ( O ) N O Padrão Interno (I.S.) tem como finalidade corrigir erros e\ou perdas por transferências e pipetagem. Uma vez que sua concentração é conhecida podemos corrigir a concentração do analito desassociando o volume. 100ng/mL 100L Razão: 5 2 1 - A c e t a D x m h z o n ( X M , I . S ) O H F 20ng/mL

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21 Voluntário 08 - 1:30h após administração
21-OH DFZ

22 Exatidão, Precisão e Recuperação
Exatidão Ruim Precisão Boa Exatidão Ruim Precisão Ruim Exatidão Boa Precisão Ruim Exatidão Boa Precisão Boa

23  Precisão  Precisão mede a reprodutibilidade de múltiplas medidas e
é usualmente descrita como desvio padrão, erro padrão e intervalo de confiança. CV% =   i = 1 N i _ ( x - x ) 2 x 100

24 Exatidão Exatidão de um método analítico mede o quão próximo
um resultado esta do seu valor REAL. Determinar a exatidão de uma medida geralmente requer a calibração do método analítico com um padão conhecido. Média Exp. Valor Teórico Erro Relativo% =  100 1 -

25 Recuperação Recuperação de um analíto em um estudo é a resposta obtida de uma quantidade do analito adicionada e recuperada da matrix biológica e comparada a resposta obtida do padrão puro. A recuperação avalia a eficiência da extração e sua variabilidade. Embora recuperações próximas de 100% sejam desejáveis, baixas recuperações podem ser utilizadas (50-60%) se forem precisas, exatas e reprodutíveis. Os experimentos de recuperação devem ser realizados comparando-se os resuldatos de amostras extraidas a três concentrações diferentes ( alta, média e baixa ) com padrões não extraidos que representam 100%.

26 Estabilidade Teste de Longo-Prazo Curto-Prazo Freezer and Thaw
Soluções de Estoque e Auto-Sampler

27 Critérios de Aprovação: Precisão
Os CV% do inter-day para os QCs é  15%, e  20% para o LOQ QC, avaliados em um mínimo de 3 lotes.

28 Critérios de Aprovação: Exatidão
A média dos valores do inter-day devem ser menores que  15% do valor nominal dos QCs, e não desviar mais que  20% para LOQ QC

29 Critérios de Aprovação: Sensibilidade
O menor ponto da curva de calibração aceitável como limite de quantificação (LOQ) do método é aquele com CV%  20% (inter-day).

30 Critérios de Aprovação: Especificidade
Respostas de picos interferentes no mesmo tempo de retenção do analíto devem ser menores que 20% da resposta de um LOQ. Respostas de picos interferentes no mesmo tempo de retenção do padrão interno (I.S.) devem ser menores que 5% da resposta de um I.S. utilizado nos estudos.

31 Critérios de Aprovação: Estabilidade
Teste de Longo-Prazo, Curto-Prazo, Freezer and Thaw, Soluções de Estoque e Auto-Sampler são propostos no SOP e variam de estudo para estudo.

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33 Estudo O ensaio de todas as amostras de um analito na matriz biológica deve ser realizado em um período de tempo cujo os dados de estabilidade sejam desponíveis. Em geral, a análise de amostras biológicas pode ser feita em determinações simples, sem a analise de duplicatas ou replicatas se estudo da metodologia tiver variabilidade aceitável como definido pelos dados da validação. Isso é utilizado em procedimentos onde as variáveis precisão e exatidão estão dentro dos limites de tolerância aceitávies. Para procedimentos com analitos labeis, onde alta precisão e exatidão são dificeis, análises em duplicata ou triplicata são recomendados para melhor estimar os análitos. .

34 A curva de calibração deve ser gerada para cada analito para ensaiar cada corrida analítica e deve ser usada para calcular a concentração do analito nas amostras de concentração desconhecida na corrida. As amostras contaminadas podem conter mais de um analito. Uma corrida analítica deve possuir todas amostras processadas a serem analisadas como um lote ou um lote composto de amostras de um ou mais voluntários, Controles de Qualidade (QC) e Padrões de Calibração.

35 A Calibração deve cobrir o intervalo de concentração esperado para as amostras com adição do LOQ. Estimações das concentrações de amostras por extrapolação na curva de calibração abaixo do LOQ ou acima do maior padrão não são recomendadas. Embora a curva possa ser redefinida ou as amostras com alta concentração possam ser diluidas e analizadas. Todas as amostras do mesmo voluntário deve ser analisada em um único lote.

36 Uma vez que o método analítico foi validado para uso rotineiro, sua precisão e exatidão deve ser monitorada regularmente para garantir que o método continua satisfatório. Para atingir este objetivo, um número de QCs deve ser analisados em intervalos baseados no numero total de amostras. Controles de qualidade em duplicata deve ser incorporado em cada corrida. Os resultados dos QC são as bases para aceitar ou rejeitar uma corrida. Pelo menos 4 de 6 devem estar em ±20% dos respectivos valores nominais. 2 de 6 Cs podem estar fora dos valores nominais, mas não na mesma concentação.

37 Documentação A validade de um método analitico deve ser estabelecida e verificada por estudos laboratoriais. A documentação da conclusão destes estudos deve ser efetivada no relatório de validação. Protocolos que definem um grupo de diretrizes específicas que devem ser seguidas são importantes se os resultados analíticos forem utéis a algum propósito.

38 SOPs específicos ou gerais são partes essenciais do método analítico validado.
Os protocolos analíticos e SOPs devem ser assinados e datados pelo diretor do laboratório e regularmente atualizados. Os dados gerados pelos experimentos de pré-estudo devem ser arquivados em um caderno de laboratório. Devem ser assinados pelo supervisor. Estes dados devem estar disponiveis para inspeções e auditorias.

39 A documentação para o pré-estudo de validação deve conter:
Descrição do método analítico. Descrição e resultados dos estudos de estabilidade. Descrição dos experimentos realizados para determinação da precisão, exatidão, recuperação, especificidade, linearidade, limite de quantificação e dados relevantes destes estudos. Tabelas com precisão e exatidão dos intra - e inter-day. Evidência da pureza das drogas, metabólitos e padrões internos utilizados nos experimentos de validação. Modificações do SOP, se houver, e justificação destas.

40 Documentação do Estudo deve conter:
Curvas de calibração usadas na análise das amostras e intra-dia exatidão e precisão. Informações dos valores inter-dia dos QC e dados do inter-dia exatidão e precisão da curva de calibração e QCs usados para aceitar a corrida. Protocolo para re-ensaio de amostras que descreve as razões do re-ensaio e os critérios para aceite destas amostras. Motivo para falta de amostras. Critérios de reprovação de amostras para analises em duplicata ( diferenca 15%) Modificações do SOP, se houver, e justificação destas.

41 Documentação para submissão às agências solicitantes:
Dados do estudo de pré-validação. Curvas de calibração, equações e fatores de tranformação (ex. 1/x2) se houver. Dados de validação do estudo. Série completa de cromatogramas de 20% dos voluntários, com padrões e QCs Todos SOP, dados obtidos, cálculos de concentração, e re-ensaio de amostras

42 Unidade Analítica Cartesius
Prof. Dr. Gilberto De Nucci Demian R. Ifa Eduardo Zappi Fabiana G. Menezes Leonardo A. Moraes Márcio Motta Mauro Sucupira Wellington Ribeiro