TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Apresentação em tema: "TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE"— Transcrição da apresentação:

1 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

2 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
* O DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado (sequência de nucleotídeos de enorme tamanho e monotonia química era geralmente analisada por meios indiretos como a sequência de proteínas); * A partir da década de 70, novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificação de genes específicos num processo chamado de CLONAGEM GÊNICA (muitas dessas técnicas são provenientes da Microbiologia, Bioquímica, Imunologia e Genética Microbiana - permitiram que a análise do DNA ganhasse um novo enfoque).

3 * A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE, como se convencionou denominar este conjunto de técnicas, tem uma ampla aplicação: Estudar mecanismos de replicação e expressão gênica, Determinar da sequência de um gene e, consequentemente, da proteína que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substâncias úteis tais como a insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades.

4 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO * Em 1953 foi descrito um estranho fenômeno no qual a eficiência da replicação de um bacteriófago (vírus de bactérias) dependia da célula hospedeira na qual ele estava inserido (percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era devido a presença de NUCLEASES altamente específicas que clivavam o seu DNA). * As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são divididas em várias classes (estrutura, atividade, sítios de reconhecimento e clivagem); * As enzimas do Tipo II (mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante) são proteínas que clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento (o sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma sequência palindrômica.

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6 Clivagem no eixo de simetria
Clivagem simetricamente situada ao redor do eixo de simetria Moléculas com extremidades abruptas Moléculas com extremidades coesivas Podem se ligar, por complementaridade, a outro DNA (DNA ligase)

7 A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrição denominada de EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI, enquanto que a Hind III é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III.

8 * Os fragmentos gerados por digestão com enzima de restrição são geralmente detectados pela separação destes fragmentos por ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE. Os fragmentos migram em função de seus pesos moleculares, sendo que os menores migram mais rapidamente.

9 CONSTRUÇÃO DE UM DNA RECOMBINANTE
1 - Uma enzima de restrição particular reconhece somente uma sequência única de bases; 2 - DNAs de origem diferente, sob a ação da mesma enzima de restrição, produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples (portanto, fragmentos de dois diferentes organismos - por exemplo, bactéria e homem - podem ser ligados por renaturação das regiões de fita simples; 3 – Ligação dos fragmentos por meio da enzima DNA ligase (ligação permanente).

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11 Esquema representativo da construção de uma molécula de DNA recombinante

12 Construção de uma molécula de DNA recombinante portando o gene humano da insulina a ser expresso em bactéria (produção em larga escala)

13 VETORES DE CLONAGEM * Após o isolamento de um determinado gene, obtido pela clivagem com enzimas de restrição, este fragmento de DNA deverá ser inserido numa outra molécula de DNA diferente, capaz de amplificar esta informação genética em centenas de cópias. Este processo de amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que são os chamados vetores de clonagem molecular. PLASMÍDEOS = pequenas moléculas de DNA circular de fita dupla, presentes em algumas bactérias BACTERIÓFAGOS OU FAGOS = desoxirribovírus (vírus de DNA) que infectam bactérias

14 Origem de replicação (sequência de DNA que permite que o vetor seja replicado na célula hospedeira)
Sítios de clivagem pelas enzimas de restrição gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina, o qual distingue a célula transformada da célula não transformada. As células transformadas com tais vetores são capazes de crescer num meio contendo o antibiótico, enquanto que as células não tranformadas acabam morrendo.

15 Replicação do fago  no interior da célula hospedeira
Replicação do fago  no interior da célula hospedeira. Após adsorção (1) e injeção (2) do genoma do fago  na bactéria, a via lítica indicada pelos números 3, 4 e 5 leva a formação de novas partículas virais. Alternativamente, a via lisogênica (6) pode ser ativada levando à integração do material genético viral ao genoma da bactéria hospedeira.

16 APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBIANTE
* PCR – Polymerase chain-reaction (reação em cadeia da polimerase) * Eletroforese * DNA Fingerpinting * Organismos geneticamente modificados e transgênicos

17 PCR – POLYMERASE CHAIN-REACTION (REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE)
* A reação em cadeia da polimerase (PCR – sigla em inglês) consiste em um método de amplificação de DNA (múltiplas cópias) sem o uso de organismos vivos, bactérias ou leveduras, por exemplo. * Não requer necessariamente o uso de radioisótopos ou outros compostos tóxicos / envolve, essencialmente, a preparação de uma mistura contendo uma amostra de DNA a ser amplificada e primers (iniciadores) específicos; * Etapas: 1 – Desnaturação da dupla-hélice de DNA; 2 – Hibridização dos primers às fitas de DNA separadas; 3 – Polimerização (extensão) da fita complementar de DNA.

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21 ELETROFORESE * Eletroforese é a técnica pela qual fragmentos de DNA de diferentes tamanhos, obtidos com o uso de enzimas de restrição, são separados em um gel de agarose. 1 - O DNA (amostra) é posto em um poço do gel de agarose; 2 – Amostra submetida a um campo elétrico; 3 – Migração do DNA na direção do pólo positivo (uma vez que a molécula de DNA é negativa devido à presença de grupamentos de fosfato); 4 – Separação dos fragmentos de acordo com o peso molecular deste (quanto maior, mais lenta a migração e vice-versa).

22 Animação eletroforese

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24 Perfil eletroforético dos lotes de mosquitos procedentes de bairros da cidade de Fortaleza (janeiro de 2006 a março de 2009), e do Parque Adahil Barreto (julho de 2007). [1 – Marcador de peso molecular (100 bp DNA ladder); 2, 3, 4, 5, 6 e 9 – lotes negativos para vírus dengue; 7 – Lote 35 exibindo banda de aproximadamente 290 pb (DENV-3); 8 – Lote 35 exibindo banda de aproximadamente 119 pb (DENV-2); 10 – Lote 34 exibindo banda de aproximadamente 290 pb (DENV-3); 11 – Lote 35 exibindo bandas de aproximadamente 119 pb e 290 pb (DENV-2 e DENV-3, respectivamente); 12 – Controle negativo; 13 – Controle positivo