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Cultura de Tecidos Vegetais
RODRIGO ROCHA LATADO
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PRINCIPAIS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
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MICROPROPAGAÇÃO DE PLANTAS
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PROPAGAÇÃO DE PLANTAS Semente (via sexuada): espécies com poucas sementes espécies sem sementes perda da germinação progênie heterogênea Vegetativa (via assexual) in vivo: estaca, enxertia, borbulha processo lento propagação de doenças sazonalidade espaço físico in vitro: meristema apical segmento nodal estímulo a gemas axilares
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MICROPROPAGAÇÃO: propagação clonal de genótipos selecionados, utilizando técnicas de cultura de tecidos, visando a produção de plantas em massa, a um preço competitivo uso de explantes com meristemas pré-existentes meristema apical: dome com células totipotentes divisão constante não tem conexão com xilema e floema ápice meristemático: dome meristemático + primórdios foliares Vantagens: > número de mudas rapidez rejuvenescimento livre de doenças espaço físico reduzido sazonalidade Desvantagens: variação somaclonal contaminação aclimatização custo protocolo
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meristema x ápice meristemático
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MICROPROPAGAÇÃO: descoberta das citocininas
descrição do meio MS EXPLANTES ápice meristemático segmento nodal: alongamento de ramo com vários nós proliferação de gemas axilares: quebra de dominância apical brotos axilares são explantes secundários para próximos ciclos Principais culturas: Banana, Cana-de-açúcar, Eucalipto, Pinus, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais
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Alongamento, desenvolvimento e enraizamento das plantas in vitro
ETAPAS DA MICROPROPAGAÇÃO Indução de brotações Introdução do explante Alongamento, desenvolvimento e enraizamento das plantas in vitro Aclimatização das plantas
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Micropropagação de baunilha Micropropagação de mandioca
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MICROPROPAGAÇÃO Estádio 0: seleção da planta matriz sanidade estádio fisiológico estado nutricional Estádio 1: estabelecimento da cultura asséptica e viável época de retirada do explante posição do explante na planta matriz baixa [ ] de citocinina; baixa [ ] de auxina Estádio 2: multiplicação alta [ ] de citocinina números de subcultivos Estádio 3: alongamento e enraizamento ácido giberélico, auxinas (IBA, NAA) Estádio 4: aclimatização controle de umidade e luz
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MICROPROPAGAÇÃO Meio de Cultura Sólido: ágar, gel melhor aeração absorção de nutrientes é deficiente Meio de Cultura Líquido: estacionário, agitação maior disponibilidade de nutrientes maior disponibilidade de água oxigenação suporte: papel de filtro, espuma Imersão Temporária: alternância de meio de cultura líquido com ausência de meio de cultura maior contato com meio de cultura ex. banana (20min. / 2h)
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CULTIVO DE MERISTEMAS PARA LIMPEZA DE VÍRUS
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LIMPEZA DE VÍRUS Doenças de Plantas: fungos, bactérias, vírus transmitidas na propagação vegetativa White (1934): vírus estão distribuídos de maneira desuniforme em raiz de fumo redução da concentração em direção à extremidade ápice radicular livre de vírus Limasset & Cormet (1949): gradiente de concentração de vírus na parte aérea Morel & Martin (1952): plantas de dália livres de vírus
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LIMPEZA DE VÍRUS - Sequência
Principais culturas: Cana-de-açúcar, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais
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LIMPEZA DE VÍRUS - Sequência
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LIMPEZA DE VÍRUS termoterapia + cultura do ápice meristemático ex: vírus do mosaico da cana-de açúcar cultura de meristema: explante 0,3 mm cultura ápice meristemático (1 – 2,5 cm) termoterapia (45oC / 8 horas) quimioterapia + cultura do ápice meristemático incorporação de antivirais no meio de cultura Indexação: avaliação da presença do vírus ensaios biológicos microscopia eletrônica serologia (ELISA) hibridação com ácido nucleico
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CULTURA DE CALOS
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CULTURA DE CALOS FASES 1. ASSEPSIA 2. EXPLANTES (discos de folhas, raiz, caule, sementes, etc...) 3. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO - INDUÇÃO DE CALOS (geralmente meio contendo auxinas) Calos em citros (meio contendo BAP) 4. DESDIFERENCIAÇÃO CELULAR - retorno das células ao estado meristemático Depende de: competência e habilidade para responder ao estímulo
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CULTURA DE CALOS 5. SUBCULTIVOS MENSAIS - mesmo meio de indução - outros meios 6. DIFERENCIAÇÃO CELULAR- utilizando uma das duas vias, - Organogênese somática - Embriogênese somática 7. REGENERAÇÃO DE PLANTAS 8. ACLIMATIZAÇÃO AO MEIO AMBIENTE
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CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO
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CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO
FASES 1. EXPLANTES (calos - células meristemáticas, alta taxa de divisão celular) 2. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO LÍQUIDO - geralmente no mesmo meio de cultivo de calos 3. AGITAÇÃO CONSTANTE (100 rpm) E ESCURO - oxigenação do meio 4. SUBCULTIVOS SEMANAIS OU QUINZENAIS - duplica ou triplica o volume celular em 7 dias
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CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO
SELEÇÃO in vitro - adição de agentes seletivos: herbicidas, toxinas purificadas, NaCl (sal), alumínio, PEG (seca) e outros 5. ALTA TAXA DE CONTAMINAÇÃO - motivo: meio líquido 6. TRANSFERÊNCIA PARA MEIO SÓLIDO - obtenção de calos 7. REGENERAÇÃO DE PLANTAS 8. ACLIMATIZAÇÃO AO MEIO AMBIENTE
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CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO Células em meio contendo
alta osmolaridade Células em suspensão Agitador orbital
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CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES
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CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES
FASES 1. ASSEPSIA 2. EXPLANTES (anteras (micrósporo), pólen, óvulos, ovários vegetais) 3. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO (pré-tratamento) 4. INDUÇÃO DE ORGANOGÊNESE OU ÊMBRIOGÊNESE - direta (sem passar pela fase de calos) - indireta (com passagem pela fase de calos) Depende de: competência e habilidade para responder ao estímulo
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CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES
FASES 5. DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS in vitro - alongamento das plantas - enraizamento - aclimatização 6. OBTENÇÃO DE PLANTAS HAPLÓIDES OU DUPLO-HAPLÓIDES - duplicação cromossômica natural ou com utilização de drogas antimitóticas - drogas (colchicina, oryzalina, hidroxiquinolina, etc... )
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CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES
Micrósporo germinando Flor Anteras Aclimatização Embriogênese somática Multiplicação
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CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES
Calos Flor - Ovário Óvulos Multiplicação Organogênese somática Obtenção de plantas
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CULTURA DE PROTOPLASTOS
VEGETAIS
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CULTURA DE PROTOPLASTOS
- Células vegetais isoladas e sem parede celular (removidas por enzimas) Enzimas Hemicelulases - digerem hemicelulose Celulases digerem celulose Pectinases digerem pectinas - sensíveis a modificação na osmolaridade do meio e a luz - meio mais concentrado protoplastos perdem água para o meio - meio mais diluído protoplastos absorvem água do meio meios geralmente entre 0,4 e 0,8M
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CULTURA DE PROTOPLASTOS
- usam manitol ou sacarose para ajustar a osmolaridade do meio - A ausência de parede celular possibilita a fusão de protoplastos - Isolamento, purificação e cultivo de protoplastos utilizando meios contendo a mesma osmolaridade MEIOS Meios CPW - Cell Protoplast Wash, MS 0,4M e MS 0,4M (2X) Solução de enzimas 0,4M Solução de Polietileno glicol a 50% Agarose tipoVII (baixo ponto de fusão) - 1,2%
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- acrescentar Manitol para o controle da osmolaridade (0,4 M)
MEIO CPW (para protoplastos vegetais ( Gilmour et al., 1989) Composição mg/L 1. CaCl2*2H2O 2. MgSO4*7H2O 3. KNO 4. KH2PO ,2 5. KI ,16 - acrescentar Manitol para o controle da osmolaridade (0,4 M) - ajustar o pH 6,0 - esterilizar SOLUÇÕES ESTOQUE CONC VOLUME USADO / L A. CaCl2*2H2O x mL/L B. OUTROS SAIS x mL/L
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CULTURA DE PROTOPLASTOS Material esterilizado
- placas de Petri - peneiras com poros de 50 m - tubos 8 ml com tampa - pipetas Pasteur
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CULTURA DE PROTOPLASTOS
FASES 1. EXPLANTES - (folhas, calos, suspensão celular, pétalas, anteras) 2. ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOS - Agitação 50 rpm, escuro, 27o C, durante 8 a 16 h. 3. PURIFICAÇÃO - peneiramento, centrifugação, retirada da solução, lavagem com CPW 4. FUSÃO - adição de PEG ou eletrofusão 5. RETIRADA DO PEG 6. CULTIVO DOS PRODUTOS DA FUSÃO - meio MS 0,4M(2X) e agarose
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CULTURA DE PROTOPLASTOS
Viabilidade de protoplastos Explante Protoplastos Fusão múltipla Fusão Fusão
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CULTURA DE PROTOPLASTOS
Primeira divisão Microcalo Microcolônia Embrião germinando Embrião somático Calos e embriões somáticos
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CULTURA DE PROTOPLASTOS
Desenvolvimento das plantas e enraizamento Placa com embriões germinando Plantas in vitro Aclimatização ao meio ambiente
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