SISTEMA RH ( ISBT – 004) O Sistema Rh é o mais complexo e polimórfico dos Sistemas de grupos sangüíneos, com 48 antígenos descritos e numerados de RH 1.

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1 SISTEMA RH ( ISBT – 004) O Sistema Rh é o mais complexo e polimórfico dos Sistemas de grupos sangüíneos, com 48 antígenos descritos e numerados de RH 1 até RH 51 HISTÓRICO Levine e Stetson Uma mulher após ter dado a luz a uma criança com DHRN apresentou reação transfusional grave após ter sido transfundida com o sangue ABO compatível do marido. O soro desta mulher aglutinava as hemácias de seu marido e de cerca de 80% dos doadores caucasianos ABO-compatíveis.

2 1940 - Landsteiner and Wiener
Soro de coelho imunizados com hemácias do Macaco Rhesus aglutinavam cerca de 85% das hemácias humanas. Inicialmente pensaram que estes Acs identificavam o mesmo Ag na superfície dos glóbulos vermelhos humanos e do macaco Rhesus ( Ag Rh). Mais tarde observaram não se tratar do mesmo Ag. Por homenagem a Landsteiner e Wiener a nomenclatura do Sistema foi mantida como Rh. O hetero-anticorpo passou a ser chamado de anti-LW O alo-anticorpo humano foi renomeado anti-D.

3 Genética Os antígenos do S. Rh são produtos de 2 pares de genes homólogos RHD e RHCE coletivamente chamado RH30 ou RHCDE RHD codifica a produção do Ag D, o mais potente antígeno de grupo sangüíneo descrito RHCE existe na forma de 4 alelos. Cada alelo codifica a produção de 2 Ags : Ce , ce , cE ou CE

4 Para que os Ags Rh se expressem é necessário a presença de uma glicoproteína produzida por um outro gene denominado RHAG ou RH50 Alterações no locus RHAG ou RH50 são raras O locus RHCDE ou Rh30 apresenta diversos diferentes alelos nas diferentes raças Localização cromossômica RHD ou RHCDE - braço curto do cromossoma 1 ( 1p34-36 ) RHAG - cromossoma 6 ( 6p11-21 )

5 PRINCIPAIS TEORIAS GENÉTICAS DO SISTEMA RH
Tippett Fisher-Race Wienner ISBT 2 pares genes pares genes 1 gen/múltiplos fatores NOMENCLATURA 1º loco º loco Gen Antígeno Gen Fenótipo Fator RHD Rhce Dce Dce R R Rh0, hr’ hr” RH1,-2,-3,4,5 RHD RhCe DCe Dce R R Rh0, rh’ hr” RH1,2,-3,-4,5 RHD RhcE DcE DcE R R Rh0, hr’ rh” RH1,-2,3,4,-5 RHD RhCE DCE DCE Rz Rz Rh0, rh’ rh” RH1,2,3-,4,-5 Rhce dce dce r r hr’ hr” RH-1,-2,-3,4,5 RhCe dCe dCe r ‘ r’ rh’ hr” RH-1,2,-3,4,5 RhcE dcE dcE r” r” hr’ rh” RH-1,-2,3,4,5

6 Antígenos do Sistema Rh

7 Complexo Rh-CD47-Rh50-LW-GPB
Current Opinion in Hematology 1997; 4:94-103

8 Distribuição tissular
RHD ou RHCDE - Importante papel na integridade da membrana eritrocitária RHAG - possibilidade de transporte de amônia Função A expressão de RHCE , RHD e RHAG é restrita ao tecido eritróide. Os antígenos Rh estão presentes nas hemácias desde a 6a semana de vida intra-uterina

9 Antígenos do Sistema Rh
Antígeno D É um mosaico com nove sub-unidades Difere dos Ags C/c e E/e em 36 aminoácidos É altamente imunogênico Cerca de 80% dos indivíduos D negativo formam anti-D após uma única transfusão de 200 ml de sangue D positivo Doadores do HEMORIO: 90% D positivo

10 Antígeno D fraco Número reduzido de antígenos RhD por hemácia sem aparente perda de epítopos Substituições de aminoácidos a nas regiões transmembranares ou intracelulares da proteína Vários tipos de D fraco já determinados molecularmente Reage de forma variada com os reagentes comerciais É detectado geralmente por técnica de Coombs ou enzimática Indivíduos D fraco devem ser considerados como D positivo e podem determinar alo-imunização materno-fetal.

11 D Fraco Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 Tipo 5 Tipo 6 Tipo 7 Tipo 8 Tipo 9
V270G Tipo 2 G385A Tipo 3 S3C G385A Tipo 5 A149D Tipo 6 R10Q Tipo 7 G339E Tipo 8 G370R Tipo 9 A294P Tipo 10 W393R

12 D Fraco Tipo 11 Tipo 4 Tipo 4.2.2 Tipo 14 Tipo 15 Tipo 16 Tipo 12
M295I Tipo 12 G277E Tipo 13 A276P Tipo 4 T201R F223V Tipo 4.2.2 T201R F223V I1025T Tipo 14 S182T K198N T201R Tipo 15 G282D Tipo 16 W220R

13 Legenda: Antígeno Epítopo
Rh(D) – Normal Rh(D) – Fraco Rh(D) – parcial Rh(D) – parcial fraco Normal Normal Variante Variante Normal Reduzido Normal Reduzido Legenda: Epítopo Antígeno

14 Proteína Rh (D Parcial e D fraco)
Flegel & Wagner, 2002

15 Recomendações Transfusionais
Pacientes D Fraco D fraco tipos 1, 2, (RhD-positivo) D fraco tipos 4, 7, (RhD-negativo) D fraco < 2+/AGH (RhD-negativo) D fraco >2+/AGH (RhD-positivo) D fraco detectado TA/370C (RhD-positivo)

16 Antígeno D deprimido por efeito de posição
A presença do haplótipo dCe deprime a expressão de D produzido por haplótipos Dce ou DCe Indivíduos Dce/dCe ou DCe/dCe podem apresentar o fenótipo D fraco

17 Antígenos C / c São proteínas de 34kDa com 417 aa C difere de c em 1 a 4 aminoácidos Freqüência dos diferentes fenótipos em doadores do HemoRio: C+ c ,3% C- c ,7% C+ c % Antígenos E / e São proteínas de 34kDa com 417 aminoáidos E difere de e em 1 aminoácido Freqüência dos diferentes fenótipos em doadores do HemoRio: E+ e ,8% E - e ,7% E+ e ,5%

18 Antígenos compostos Antígeno ce ou f ( Rh6 ) c / e estão no mesmo complexo Antígeno Ce ( Rh7 ) C / e estão no mesmo complexo Antígeno cE ( Rh27 ) c / E estão no mesmo complexo Antígeno CE ( Rh22 ) C / E estão no mesmo complexo

19 Haplótipos deprimidos
Os antígenos apresentam reatividade diminuída ou nula Rh 33 - (D) c (e) Rh 36 - d ( c ) ( e) Rh 32 - D (C) (e) Rh 35 - D (C) e Haplótipos silenciosos Os antígenos estão ausentes Haplótipos parcialmente silenciosos D-- = Ag C/c , E/e ausentes e reatividade de D e G aumentada D.. = Ag C/c , E/e ausentes e reatividade de D e G normal D( c) - reatividade de D exacerbada, c diminuído , e ausente

20 Haplótipos totalmente silenciosos
Rh null ( ---/---) gem amorfo Dose dupla do haplótipo silencioso ( ---/---) Rh null ( ---/---) devido a gem regulador locus X1r regula os genes DCE genes LW

21 ANTICORPOS Praticamente todos os anticorpos do Sistema Rh resultam de alo-imunização feto-materna ou transfusional Quase sempre são IgG ( IgG1 , IgG3) Há raros anticorpos naturais IgM com especificidade anti-Cw e anti-E Anti-D Anticorpo de maior freqüência no soro humano. Determina casos graves de reação transfusional e doença hemolítica peri-natal.Trata-se de uma potente IgG, ativa a 37o C, demonstrada pelas técnicas de antiglobulina humana e enzimática. Em geral este anticorpo não ativa a cascata do complemento. Em raros casos podemos observar um componente IgM determinando aglutinação direta com hemácias D positivas. 30% dos casos de anti-D estão associados a anti-C. Cerca de 10% dos doadores de sangue são D negativos.

22 ANTICORPOS Anti-C Identificar anti-C sozinho é raro. Comumente o encontramos associado ao anti-D. Determina reação transfusional e doença hemolítica peri-natal. Geralmente é uma IgG imune, detectada pela técnica de antiglobulina humana e técnica enzimática, porém podemos observar alguns casos de anti-C IgM de ocorrência natural, determinando aglutinação direta com hemácias C positivas. 44% dos doadores de sangue do município do Rio de Janeiro são C negativos.

23 Anti-Cw Anti- Cw raramente determina reação transfusional ou doença hemolítica peri-natal. Geralmente é uma IgG imune, detectada pela técnica de antiglobulina humana e técnica enzimática, porém podemos observar alguns casos de anti- Cw IgM de ocorrência natural determinando aglutinação direta com hemácias Cw positivas. Anti-E Anti-E geralmente é uma IgG ativa a 37o C demonstrada pela técnica de antiglobulina humana e técnica enzimática. Em geral podemos observar um componente natural IgM determinando aglutinação direta com hemácias E positivas. Este anticorpo determina reação transfusional, mas raramente está associado à doença hemolítica peri-natal. Cerca de 74% dos doadores de sangue do Rio de Janeiro são E negativos. Em indivíduos c negativos é comum a ocorrência da associação do anti-E com anti-c.

24 Anti-c Anti-c é um anticorpo freqüente em indivíduos c negativos. Está associado a casos de reação transfusional e doença hemolítica peri-natal. Trata-se de uma IgG ativa a 37o C demonstrada pela técnica de antiglobulina humana e técnica enzimática. Cerca de 12% dos doadores de sangue são c negativos. Anti-e Este é um anticorpo incomum no soro humano. Pode causar reação transfusional e doença hemolítica peri-natal. Trata-se de uma IgG imune, ativa a 37o C, demonstrada pela técnica de antiglobulina humana e técnica enzimática. Podemos observar também como auto-anticorpo IgG. Cerca de 2,5% dos doadores de sangue são e negativos.

25 Anti-G Anti-G é um anticorpo raro, porém pode determinar reação transfusional e doença hemolítica peri-natal. Geralmente é uma IgG ativa a 37o C demonstrada pela técnica de antiglobulina humana e técnica enzimática. Cerca de 14% dos doadores de sangue são G negativos, sendo todos também D negativos

26 SISTEMA RH E PATOLOGIAS
Os Anticorpos anti-Rh determinam reação transfusional importante e estão associados a Doença hemolítica Peri-natal. Existe relato de casos de doença enxerto versus hospedeiro( GVH) relacionada aos Ags Rh. HEMOPATIAS Leucemia Mielóide crônica Metaplasia Mielóide Policitemia , Mielofibrose Podem apresentar populações eritrocitárias de 2 tipos de Rh devido a alterações na expressão destes antígenos. A ausência ou a redução dos polipeptídeos Rh30 e ou de seus Ags associados devido a gem Rh null ou gem Rhmod podem determinar um quadro de ANEMIA HEMOLÍTICA compensada e ESFEROCITOSE

27 ANEMIA HEMOLÍTICA AUTO-IMUNE (AHAI)
Os anticorpos deste Sistema estão associados a casos de anemia hemolítica auto-imune (AHAI). Podemos observar auto-anticorpos com especificidades comuns: anti-e , anti-c, anti-E , anti-C , anti-D. Ou com especificidades mais complexas: Anti-nl São anticorpos que reagem apenas com hemácias Rh normais, mas, não com deleções.  Anti-pdl São anticorpos que reagem com hemácias Rh normais e também com hemácias com deleções porem não reagem com hemácias Rh null  Anti-dl São anticorpos que reagem com qualquer hemácia e também com hemácias Rh null

28 SISTEMA RH E DOENCA HEMOLITICA PERI-NATAL
Os antigenos do Sistema Rh estão presentes na 6a semana de vida intra-uterina.

29

30 Percentagem de Anticorpos do Sistema Rh em 602 gestantes
IFF - Pessoa 2004

31 DETERMINAÇÃO DO TIPO Rho (D)
Tipagem rotineira do Rh refere-se somente ao antígeno Rho (D) e, quando esta é negativa, à técnica para detecção do Fator Du (variação do antígeno D, denominado D fraco atualmente). Denomina-se Rh positivo o indivíduo Rho (D) positivo e Rh negativo aquele em que a tipagem para Rho (D) e Du foi negativa. Contrariamente ao sistema ABO, não há prova reversa. Os indivíduos não apresentam naturalmente anticorpos séricos contra o antígeno D. D Ctl O soro anti-Rho (D) contém anticorpos imunes, IgG, anti-Rho (D) e potencializadores que provocam aglutinação rápida e visível desses anticorpos com os antígenos D. Em virtude desse meio com alto peso molecular, podem ocorrer reações falso positivas. Por isso a determinação do tipo Rho (D) exige a utilização em paralelo, de um controle negativo, o controle Rh.

32 DETERMINAÇÃO DO TIPO Rho (D)
Ctl Controle Rh: é um reagente que contém o meio macromolecular utilizado na fabricação de soro anti-Rho (D), mas que é imunologicamente inerte (isto é, não contém anticorpos). Os meios macromoleculares contidos no soro anti-D, variam de fabricante a fabricante e portanto o controle de Rh também varia. Como este é um testemunho negativo, ele deve ser do mesmo fabricante do anti-D utilizado.

33 DETERMINAÇÃO DO TIPO Rho (D)
1.  Identificar dois tubos de ensaio, como D e CTL. 2.  No tubo identificado como D, colocar uma gota de soro anti Rho (D) e no tubo identificado como CTL, uma gota de Controle Rh; 3.  Aos dois tubos adicionar uma gota de suspensão de GV a 5% em solução salina. Essa suspensão, pode ser feita no próprio plasma ou soro; 4.  Misturar bem e centrifugar os dois tubos a 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto; 5. Ressuspender o sedimento, agitando delicadamente os tubos e ler macroscopicamente a aglutinação; 6.  Se o teste for negativo (aglutinação ausente), proceder conforme indicado no teste para pesquisa de D fraco. D D Ctl Ctl    

34 4. Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto;
Pesquisa de D fraco 1.  Incubar ambos os tubos (D e CTL) por 15 minutos em banho-Maria a 370C; 2.  Lavar os GV de cada tubo por três vezes, em solução salina fisiológica. Decantar completamente por inversão rápida dos tubos, após a última lavagem; 3.  A cada tubo, acrescentar duas gotas de soro anti-globulina humana de amplo espectro ou soro de Coombs; 4.  Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto; 5.  Ressuspender o "botão" de GV, por agitação delicada e examinar para aglutinação macroscópica; 6. Anotar os resultados D Ctl D Ctl D Ctl D Ctl D Ctl D Ctl D   Ctl  

35 Interpretação dos resultados
Ctl D Ctl Ctl Aglutinação com anti-D e ausência de aglutinação no reagente Ctl. Rh positivo Ausência de aglutinação nos 2 tubos anti-D e Ctl Rh negativo Ausência de aglutinação nos 2 tubos anti-D e Ctl Realizar pesquisa de D fraco D Ctl Aglutinação com o reagente Controle invalida a interpretação dos resultados D Ctl Aglutinação com anti-D e ausência de aglutinação no reagente Ctl. Rh positivo fraco (D fraco)

36 Interpretação dos resultados
Havendo ausência de aglutinação em ambos os tubos (item 5), classifica-se o sangue como o Rh negativo. Quando ocorre aglutinação apenas no tubo marcado D (item 5), o sangue deve ser classificado como D positivo (ou variante do D) e portanto Rh positivo. Se ambos os tubos, D e CTL, aglutinarem, não considerar o indivíduo como Rh positivo. Neste caso, considera-lo como tendo um teste de Coombs direto positivo, provavelmente por sensibilização de seus GV por auto-anticorpos. Caso não haja tempo de realizar estudos mais aprofundados, na vigência de uma transfusão de urgência, escolher para essa transfusão um sangue Rh negativo.

37 CLASSIFICAÇÃO SANGUÍNEA Rh (D)
REAGENTE CONTROLE POSITIVO REAGENTE CONTROLE NEGATIVO VALIDAD E DO TESTE TESTE DE COOMBS DIRETO POLIESPECÍFICO MONOESPECÍFICO ANTI-D SALINO TRATAMENTO DAS HEMÁCIAS COM REAGENTES ESPECIAIS COMO CLOROQUINA OU DIGITONINA ÀCIDA HEMÁCIAS SENSIBILIZADAS “IN VIVO” AUTO- ANTICORPOS ALO- ANTICORPOS