Disciplina: Introdução à Biotecnologia

Apresentação em tema: "Disciplina: Introdução à Biotecnologia"— Transcrição da apresentação:

1 Disciplina: Introdução à Biotecnologia
Estratégias Moleculares na Avaliação da Diversidade Microbiana em Amostras Ambientais Aluna: Catarina Macedo de Figueirêdo Orientadora: Margarida Matos de Mendonça Disciplina: Introdução à Biotecnologia

2 Diversidade Microbiana
Milhões ⇨ estima-se ser o número real de seres vivos; 1,5 Milhões de organismos vivos ⇨ identificados. Bactérias ⇨ 5 mil espécies ⇨ 100 mil a 1 milhão de espécies Fungos ⇨ 100 mil espécies ⇨ 200 patogênicas aos seres vivos Protozoários ⇨ 20 mil espécies ⇨ poucas são patogênicas. (TORTORA, et al., 2005)

3 Ambientes da Diversidade Microbiana
Ampla Microbiota Solo Rizósféricos Águas Residuais Sistemas de Lodo Ativado Baixa Microbiota Ar Ambientes Marinhos Águas Doces Solo

4 Avaliação da Diversidade Microbiana
⇨ fracamente conhecida ⇒ culturabilidade. CULTURABILIDADE CULTURA PURA TÉCNICAS MOLECULARES NOVAS TÉCNICAS DE CULTIVO

5 Estratégias de Detecção
- Identificação - Quantificação Técnicas Dependente de Cultivo Independente de Cultivo

6 Técnicas dependentes de cultivo
Culturas Puras Isolamento Cultivo Identificação Falha na detecção de microrganismos. Complexa formulação dos meios de cultura. Técnicas clássicas: bioquímica e microbiologia ➭ baixa determinação da biomassa e da estrutura. Falsa representação da diversidade microbiana em amostras ambientais. Tempo. (HURST, et al., 1997)

7 Técnicas independentes de cultivo
Descrição da diversidade microbiana; Definição da estrutura e dinâmica de comunidades complexas; Técnicas moleculares; Desenvolvimento de novos métodos moleculares de identificação de microrganismos não cultiváveis. (WALNER, et al., 1997; LEE, et al., 1999; NILSEN, et al., 1999; FOSTER, et al., 2003)

8 Águas Residuais Esgoto:
“ Líquido caracterizado pelos despejos provenientes das diversas modalidades de uso e de origem das águas, tais como as de uso doméstico, comercial, industrial, utilidade pública, de áreas agrícolas, de superfície, de infiltrações, pluviais e de outros efluentes sanitários.” (JORDÃO & PESSOA, 1995)

9 Características do Esgoto
Domésticos – Despejos domésticos, pluviais, infiltrações e pequenas parcelas industriais Esgotos Industriais – provêm de qualquer utilização da água para fins industriais. Características do Esgoto Matéria sólida Odor Cor e turbidez - Físicas (JORDÃO & PESSOA, 1995)

10 Matéria inorgânica: areia, substâncias minerais dissolvidas.
Matéria Orgânica: proteínas, carboidratos, gorduras e óleos, uréia, surfactantes, fenóis, pesticidas Matéria inorgânica: areia, substâncias minerais dissolvidas. - Químicas Bactérias Fungos Vírus Algas Protozoários - Microbiológicas (JORDÃO & PESSOA, 1995)

11 Tratamento de Esgoto Objetivo:
“ Separar a água dos componentes sólidos, com a intenção de purificar a água, tornando-a livre de patógenos e poluentes, podendo ser liberada ao meio ambiente.” (HURST, et al., 1997) Etapas: Processo físico Processo químico Processo biológico (JORDÃO & PESSOA, 1995)

12 Tratamento Secundário
Tratamento de Esgoto Tratamento Primário Tratamento Secundário Tratamento Terciário Processo Químico Processo Biológico Processo Físico

13 Processo biológico Lodo ativado Oxidação do lodo (aeróbia)
Tratamento de Esgoto Oxidação do lodo (aeróbia) Digestão do lodo (anaeróbia) Processo biológico Lodo ativado É uma fase essencialmente biológica no sistema de tratamento de esgoto doméstico e industrial, realizada aerobicamente. “ O lodo ativado é composto por materiais sedimentados provenientes das seqüências de águas residuais e de sólidos gerados pelo processo de tratamento de esgoto” (DAVIS & CORNWELL, 1998)

14 Lodo Ativado Forma livre Microrganismos Agregada - flocos - Agitação
- Suplemento de O2 - Dispersão microbiana Aeração Biomassa floculada Sólidos ⇨ retornam ao compartimento aeróbico Sedimentação

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19 Compostos inorgânicos
Lodo Ativado Multiplicação Crescimento celular Compostos orgânicos [ O2 ] Produção de energia Compostos inorgânicos Produção de CO2, NO3, O2, SO4, PO 4, H2O.

20 Características Físico-Químicas:
Lodo Ativado Características Físico-Químicas: Matéria orgânica, nutrientes, metais pesados, compostos inorgânicos potencialmente tóxicos. Finalização inadequada do tratamento: Riscos à saúde, acúmulo de metais pesados ou compostos orgânicos no solo ou no efluente. Microbiologia do Lodo Ativado (GONÇALVES, et al., 1999) Diversidade microbiana Dinâmica das populações Predomínio bacteriano (GRAY, 1990)

21 Bactérias Lodo Ativado Dispersas na fase líquida
Associadas ao floco e participando de sua estrutura Associadas ao floco, mas não participando da sua formação Bactérias do afluente ≠ bactérias do lodo pH Temperatura O2 Nutrientes Agitação Carga afluente Idade. Fatores (HURST, et al., 1999; GRAY, 1990)

22 Gêneros envolvidos no consumo da matéria orgânica
Lodo Ativado Gêneros envolvidos no consumo da matéria orgânica Acinetobacter Hyphomicrobium Alcaligenes Microbacterium Bacillus Pseudomonas Brevibacillus Sphaerotilus Canlobacter Debaromyces Comomonas Flavobacterium Cytophaga (GRAY, 1990)

23 Desnitrificantes Nitrificantes Lodo Ativado Uréia ⇨ NH4⇨ NO3 NO3 ⇨ N2
Nitrosomonas Pseudomonas Nitrospira Denitrobacillus Nitrocystis Spirillum Nitroglea Micrococcus Nitrobacter Xanthomonas Nitrococcus Nitrospina (GRAY, 1990)

24 Fungos Protozoários Lodo Ativado Pequena incidência;
Estão associados à estrutura do floco Associado a Idade pH < 6,0 ⇨ dominância fúngica Protozoários Componente comum; Gêneros resistentes ⇨ Giardia e Cryptosporidium

25 Vírus Lodo Ativado Organismos aquáticos ou patógenos ao homem.
Grupos Presentes: Enterovirus Orthoreovirus Rotavirus Mastaadenovirus Bacteriófagos ⇨ material fecal Doenças entéricas

26 Métodos Moleculares: Estudo das sequências de rRNA.
Técnicas Moleculares Utilizadas na Identificação Microbiana no Lodo Ativado Métodos Tradicionais Isolamento; Identificação: morfologia e bioquímica. (LIU, et al., 2005) Métodos Moleculares: Estudo das sequências de rRNA. Identificação da microbiota Técnica independente de cultivo Determinação da diversidade (DAHLLOF, 2002)

27 CULTURA FISH AMOSTRAS PCR in situ MICROARRANJOS EXTRAÇÃO HIBRIDIZAÇÃO PCR CLONAGEM DGGE, TGGE SEQÜÊNCIAMENTO (DAHLLOF, 2002)

28 Hibridização in situ e FISH
Metodologia Hibridização de uma seqüência alvo de DNA ou de RNA com uma sonda de oligonucleotídeos marcada quimicamente ou radioativamente. Sondas ➭ Específicas ➭ Identificação dos microrganismos. FISH Técnica Molecular ➭ Independente de cultivo Possibilidade de identificação da diversidade microbiana, sem alteração da sua estrutura espacial. (COOPER, 2002; ALBERTS, et al., 2006)

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31 FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado
Inúmeros trabalhos relatam a utilização da técnica de FISH na avaliação da diversidade microbiana nos sistemas de Lodo Ativado.

32 FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado
Chen et al., 2003 Análise de seqüências específicas de 16S rRNA Estudo as alterações na prevalência de organismos de acordo com a concentração de cloro: Concentração de Cl- ⇒ mg/L Oxidantes de NH4 ⇒ Predominância de Nitrossomonas Oxidantes de NO2 ⇒ Nitrobacter Redução do floco ⇒ ↑ da [ Cl-] Até 10 mg/L ⇒ mesma predominância ⇒ ↑ 10 mg/L diferentes espécies de Nitrossomonas Nitrobacter ⇒ Predominância contínua.

33 Fonte: CHEN, et al., 2003

34 Fonte: Chen et al., 2003

35 FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado
Liu et al., 2005 Análise de seqüências específicas das subunidades 16S do rRNA. Estudo para identificação das EBPR (bactérias removedoras de P). Análise do PPs intracelulares (PAOs) ⇒ DAPI Sondas: EUB 338, GAM 42ª, ACA 23 Protebacteria ⇒ Prevalência de 70 % ⇒ -Proteobacteria ⇒ 60 % Gênero Acinetobacter ⇒ 31 % ⇒ Não caracterizada como PAO (organismo acumulador de polifosfatos) PAOs não foram caracterizados ⇒ sequênciamento ⇒ pequena similaridade com Banco de Genes.

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37 FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado
Wong et al., 2005 Hibridização de seqüências – alvo de rRNA com sondas fluorescência (FISH) Estudo para identificação de EBPRs ⇒ PAOs, GBs Sondas: EUB mix, PAO mix, actino_1011 EUB mix ⇒ 9 % de PAOs Rhodocyclus ⇒ β- Proteobacteria predominância dentre as PAOs ⇒ 10-30% das Eubacteria Tretrasphera ⇒ Actinobacteria ⇒ actino_1011 ⇒ 7-10%; β- Proteobacteria apresentaram-se predominantes com 25% 30-60% da população ⇒ EBPRs

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39 Conclusões Vantagens da Utilização da Técnica de FISH:
FISH possibilita a avaliação da diversidade microbiana sem a necessidade de cultivo; Possibilita a quantificação e determinação da estrutura da comunidade microbiana; Permite a detecção das alterações da prevalência microbiana nas comunidades estudadas; Diversas metodologias que podem ser específicas às células a serem hibridizadas; Técnicas de metodologias relativamente rápidas e de fácil execução, em relação às técnicas dependentes de cultivo.

40 Desvantagens da utilização da Técnica de FISH:
Identificação de microrganismos específicos; Na determinação da microbiota de uma comunidade ⇨ utilização de muitas sondas diferentes; Custo relativamente alto; Sobreposição das sondas hibridizadas ⇨ Alteração das cores emitidas pelas sondas ⇨ dificuldade na identificação do microrganismo; Metodologias dependentes da permeabilidade dos microrganismos em relação a entrada das sondas.