Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Definições: pirogênio endógeno e exógeno.

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1 Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Definições: pirogênio endógeno e exógeno , endotoxina bacteriana (lipopolissacáride) Aplicação e abrangência Ações biológicas da endotoxina bacteriana Métodos de despirogenização e sua aplicação em produtos estéreis Produtos Apirogênicos Teste de pirogênio: método de detecção in vivo Teste de endotoxina : método de detecção in vitro – Kit LAL Vantagem e desvantagens dos métodos in vivo e in vitro

2 Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Pirogênio: Substância que induz a febre, proveniente de um produto injetável. São divididos em 2 classes: Pirogênios exógenos b) Pirogênios endógenos

3 Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Pirogênios exógenos: São substâncias originárias fora do corpo e induzem a elevações térmicas quando injetados em humanos e animais. Ex.: Endotoxina bacteriana (lipopolissacarídeo) Mais importante pirogênio exógeno. Outros Pirogênios exógenos: bactéria, fungo, vírus e outros não microbianos, como por exemplo fármacos, esteróides, frações do plasma, e adjuvante sintético muramil dipeptídeo. Produtos estéreis = ausência de microrganismos viáveis e apirogênicos

4 Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Endotoxinas bacterianas: São complexos de alto peso molecular associados a membrana externa de bactérias Gram negativas, sejam elas patogênicas ou não. - São altamente resistentes ao calor, dessecação, tratamentos químicos e pH extremos. São liberadas durante o processo de multiplicação bacteriana ou quando morrem.

5 Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Cont. Endotoxinas bacterianas: - Constituem maior fonte de pirôgenio para a Indústria Farmacêutica * Diferença entre endotoxina e lipolissacarídeo (LPS)

6 A atividade biológica da endotoxina está associada ao LPS da membrana externa de bactéria Gram negativa

7 Produtos estéreis: ausência de m.o viáveis e apirogênicos
Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Pirogênios endógenos: É produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estímulo de pirogênio exógeno. Produtos estéreis: ausência de m.o viáveis e apirogênicos

8 Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Aplicação: Produtos farmacêuticos injetáveis , como fármacos, soluções de injetáveis de pequeno e grande volume. Produtos correlatos ligados a injetáveis ( seringas, agulhas, catéteres) Embalagens de acondicionamento de produtos injetáveis Próteses Fluidos para infusão

9 Ações Biológicas da Endotoxina Bacteriana
- São tóxicas para a maioria dos mamíferos Quando injetadas - injeção de células vivas, mortas ou purificadas (LPS), podem causar várias reações fisiológicas, tais como: Febre Alteração na contagem de leucócitos Coagulação intravascular Hipotensão Apatia Dores de cabeça Convulsão Até mesmo a morte Devido a estes fatores, é de grande importância a detecção e eliminação das endotoxinas bacterianas de produtos farmacêuticos injetáveis

10 Processos de Despirogenização
Existem 2 grandes classes de Processos de Despirogenização: Processo de Inativação Processo de Remoção

11 Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina Hidrólise ácido – básica ou alcalina Reduz ou elimina a atividade do LPS, pela desativação do lipídeo A ( considerado responsável pela ação biológica) HCl 0,05N por 30 min a 100ºC ou Ácido acético glacial 1% por 2 – 3 h a 100ºC Aplicação: Despirogenização de materiais

12 Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina 2) Oxidação - Inativação oxidativa da endotoxina bacteriana com peróxido de Hidrogênio (H2O2). É dependente do tempo, pH e concentração. Aplicação: Eliminação de pirogênio da água estéril para injeção USP, solução salina normal, salina dextrose, lavagem de componentes plásticos na fabricação de correlatos. Vantagem : ausência de peróxido no final do processo Outros produtos, porém com limitações: ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido nítrico, dióxido de selênio,entre outros.

13 Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina 3) Alquilação Um agente alquilante é o gás óxido de etileno, que, segundo alguns estudos, pode promover a redução da atividade de endotoxinas bacterianas, além de promover a esterilização de produtos. Aplicação: produtos médicos - hospitalares Outros agentes alquilantes: tratamento com anidridos acéticos e succínico

14 Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina 4) Processo térmico – Calor seco Estufas Túneis por convecção, condução ou irradiação (Infravermelho) Aplicação: Método de escolha para materiais temoresistentes, como frascos de vidro e instrumentos metálicos Processo de despirogenização: Exposição do material a 250ºC , no mínimo por 30 min. Ocorre incineração. Autoclavação não é efetiva para inativação de endotoxinas

15 Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina 5) Radiação Ionizante Cobalto ( Co60) - Reduz a toxicidade de endotoxinas, porém, são dose dependentes. Pode aumentar alterações químicas desconhecidas em fármacos e soluções parenterais. - Seu uso na despirogenização de materiais não tem sido considerado. Seus riscos podem superar suas propriedades benéficas

16 Processos de Despirogenização
Processo de Inativação da Endotoxina 6) Polimixina B - Antibiótico pode anular a atividade do LPS. - Mais estudos devem ser feitos, pois a Polimixina pode interferir no teste LAL ( para determinação de endotoxina bacteriana in vitro)

17 Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina 1) Lavagem - Método mais simples e um dos mais antigos para remoção de endotoxinas. - Efetivo Lavagem com solvente apirogênico : Água estéril para injetáveis USP. Aplicação: Vidrarias, dispositivos médicos, tampas e superfícies de materiais.

18 Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina 2) Destilação - Método mais antido para remoção de endotoxinas. Mecanismo: Alteração de fase: L para V – Água ( vapor) e LPS ( Líquido) LPS ( Alto peso molecular) : tende a cair, devido a gravidade. b) V para L – Água Condensa, sem as endotoxinas. Aplicação: Remoção de pirogênio da água

19 Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina 3) Ultrafiltração Utilização de membranas ultrafiltrantes Tamanho da subunidade básica do LPS: a daltons. Mecanismo: Filtros despirogenantes – exclusão por peso molecular / tamanho da partícula. Aplicação: Fármacos (ex. antibióticos) e soluções de baixo a médio peso molecular.

20 Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina 4) Osmose reversa Filtração sobre pressão . Membranas constituída de acetato de celulose ou poliamida, com pequenos poros para exclusão de partículas. Mecanismo: Exclusão por tamanho - poros pequenos impedem a passagem de pirogênios. Aplicação: Produção de água estéril para injeção. Método reconhecido pela USP, assim como o processo de Destilação. - Consegue remover de 99,5 a 99,9 % da carga pirogênica do sistema.

21 Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina 5) Carvão Ativado Adição de carvão a solução Pode ser aplicado em ampla faixa de pH Mecanismo: Adsorção de partículas pirogênicas (endotoxina) , agitação e remoção do carvão por filtração. Aplicação: Soluções de eletrólitos. Limitações: Pode ocorrer a adsorção de ingredientes ativos, devido sua afinidade por subst. não ionizáveis de elevado peso molecular.

22 Processos de Despirogenização
Processo por Remoção de Endotoxina 6) Atração por membrana hidrófoba Polímeros de polipropileno, polietileno, polifluoreto de vinilideno e politetrafluoretileno apresentam afinidade para ligação a endotoxina. Mecanismo: Processo de microfiltração com estes materiais são empregados permitem efetiva eliminação de endotoxinas por ADSORÇÃO Aplicação:Subst. instáveis hormônios, antibióticos e substâncias difíceis de despirogenizar pelos métodos tradicionais.

23 Produtos Apirogênicos:
È importante ressaltar que: Apesar dos métodos de despirogenização, existem limitações ( natureza do produto, riscos envolvidos ou aspectos econômicos) Deve – se avaliar a natureza do produto ara escolha do processo de despirogenização adequado. É importante seguir a BPF, para que se possa obter um produto apirogênico e não haver necessidade de tratamentos adicionais

24 Teste de Pirogênio Teste in vivo Teste in vitro

25 Teste de Pirogênio : Método in vivo
Também conhecido como Método biológico ou Método in vivo Teste de hipertermia realizado em coelhos. Consiste em injetar uma solução nas veias periféricas das orelhas de coelhos. Após a injeção, verifica-se se ocorre uma reação pirética, ou seja, um aumento da temperatura do corpo do animal (febre). - A elevação da temperatura indicará a presença de pirogênios na solução.

26 Teste de Pirogênio : Método in vitro
Também conhecido como Teste LAL ou Método in vitro Teste LAL (Limulus Amebocyte Lysate): proteína de caranguejo - Caranguejos de espécie Limulus polyphemus - Ocorre uma reação entre o componente proteico do LAL e a endotoxina bacteriana. Consiste em adicionar o reagente LAL , que é uma proteína que coagula ou gelifica na presença de endotoxinas bacterianas.

27 Teste de Pirogênio : Método in vitro
Métodos analíticos Ponto Final de Gelificação Mais simples e amplamente utilizado Consiste em adicionar solução e reagente em quantidades iguais em tubo de ensaio despirogenizado. Mistura-se LAL com a solução a ser analisada e incuba-se por 1h a 37ºC. Inversão dos tubos a 180º Positivo: formação de gel Negativo : não formação de gel

28 Teste de Pirogênio : Método in vitro
Métodos analíticos 2) Ensaio Turbidimétrico Permite medida quantitativa da endotoxina em diferentes faixas de concentração O método é baseado no fato em que: Aumento da concentração de toxina é proporcional ao aumento da turbidez da solução, devido a ppt de proteína coagulável. Mistura se a solução com o reagente e incuba-se para reação da endotoxina. Realiza-se a leitura em espectrofotometria de absorção, calculando-se a concentração (compara-se com padrão).

29 Questão Provão / ENADE – 2001
As diálises peritoneais, administradas em pacientes em hospitais, têm sido causa de infecções. As análises das soluções determinaram a presença de pirogênio. Quais as consequências para um paciente que recebe formulações medicamentosas injetáveis contaminadas com pirogênio? b) Como é realizada a pesquisa do pirogênio em medicamentos?