Genética Molecular Transcrição.

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1 Genética Molecular Transcrição

2 Genética Molecular Dogma central da biologia molecular: a informação genética segue um fluxo unidirecional. transcrição reversa DNA RNA polipeptídeo replicação transcrição tradução

3 Transcrição: ato ou efeito de reproduzir por meio de cópia.
Processo a partir do qual a informação genética de certos segmentos de DNA (os genes) especifica a síntese de RNA. Somente pequena parcela do DNA total das células é transcrito. E deste, apenas uma pequena porção é traduzido (eucariotos): Algumas unidades de transcrição expressam-se produzindo outras moléculas de RNA que não especificam polipeptídeos. O transcrito primário das unidades de transcrição que codificam polipeptídeos está sujeito a eventos de processamento de RNA Apenas uma parte do mRNA maduro é traduzida

4 Genoma = DNA codificante + DNA não-codificante (“DNA lixo”)
Transcrição Genoma = DNA codificante + DNA não-codificante (“DNA lixo”)

5 Genes: tradicionalmente é a unidade fundamental da hereditariedade.
Transcrição Genes: tradicionalmente é a unidade fundamental da hereditariedade. Na genética moderna, é uma seqüência de nucleotídeos do DNA que pode ser transcrita em uma versão de RNA. Também pode ser visto como um segmento de um cromossomo a que corresponde um código distinto, uma informação para produzir uma determinada proteína ou controlar uma característica. Estrutura de um gene – inclui regiões que antecedem e que seguem a região codificadora, bem como sequências que não são traduzidas (íntrons) que se intercalam aos segmentos codificadores individuais (éxons), que são traduzidos.

6 Transcrição Estrutura do gene Procariotos Eucariotos

7 Principio: complementaridade de bases.
Transcrição Principio: complementaridade de bases. Filamento de DNA transcrito – fita molde. Filamento de DNA complementar – fita não-molde mRNA possui igual seqüência que a fita não-molde (trocando T por U).

8 Transcrição em Procariotos
Ocorre diretamente no citoplasma (procariotos não possuem núcleo). Um tipo de RNA polimerase. Início Alongamento Término RNA polimerase Síntese 5’ -> 3’

9 Transcrição em Procariotos
Início RNA polimerase (fator sigma) reconhece e se liga especificamente à região promotora (região -35 e -10). DNA ainda em dupla hélice – complexo fechado. DNA é aberto em fita simples na região próxima da iniciação da transcrição (região +1) – complexo aberto – formação da bolha de transcrição. A RNA polimerase transcreve o DNA, mas produz cerca de 10 transcritos abortivos, que não conseguem sair da enzima uma vez que o canal de saída está bloqueado pelo fator sigma. Eventualmente o fator sigma se dissocia da enzima, e a transcrição se procede. NTP’s são substrato da enzima, e fornecem a energia a partir da quebra do trifosfato em monofosfato

10 Transcrição em Procariotos

11 Transcrição em Procariotos
Término Direto / Intrínseco / Rô-independente: envolve seqüência de terminação (sequência palindrômica com ca. 40pb com região rica em GC seguido por repetições de A). Formação de alça em grampo – dissociação da RNA pol da fita molde. Rô-dependente: usa um fator de término (rô) para parar a síntese num ponto específico. mRNA’s com sinais de término dependentes de rô não possuem seqüência palindrômica. Rô (hexâmero) – ligação à região rut – separação do RNA da RNA pol – Translocação de rô ao longo do mRNA. Sequência palindrômica: Sequência de bases no sítio de reconhecimento, lida de 5´para 3´, é a mesma em ambos os filamentos (e.g., 5´-GAATTC-3´; 5´-CTTAAG-3´; 5´-AAGCTT-3´; 5´TTCGAA-3´).

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13 Transcrição em Eucariotos
Trancrição Transcrição em Eucariotos Envolve mais fatores de transcrição que procariotos. Transcrição ocorre no núcleo. Três tipos de RNA polimerase: I - trancreve o rRNA. II - trancreve o mRNA. III - transcreve o tRNA, snRNA e outros RNA’s pequenos. Regulação: Dependende de fatores cis- e trans-atuantes. Processamento do mRNA - Regulação pós-transcripcional.

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15 Transcrição em Eucariotos
Padrão de sequêncial de ligação dos Fatores de transcrição. 1) TFIID se liga ao TATA box; 2) Ligação de TFIIA e TFIIB. 3) Complexo resultante se liga à RNA polimerase II, a qual já se ligou ao TFIIF. 4) Complexo de iniciação é completado com a adição de TFIIE, TFIIJ, e TFIIH. 5) Depois de um passo de ativação (fosforilação dependente de ATP) da RNA polimerase II, esta pode iniciar a transcrição no ponto de início (+1).

16 Tipos de RNA: estrutura e função
Genética Molecular Tipos de RNA: estrutura e função

17 Tipos de RNA: estrutura e função

18 Tipos de RNA: estrutura e função
Diferentes elementos estruturais na estrutura secundária do RNA. A - hairpin loop B - stacking C - bulge loop D - interior loop E - multi loop F - exterior loop G - dangling nucleotide H - par que não G-C I - Coaxial stacking

19 Tipos de RNA: estrutura e função
RNA’s informacionais mRNA – carrega informação genética pros ribossomos (expressão gênica). Procariotos: transcrito prim’ario = mRNA Eucariotos: transcrito prim’ario = pré-mRNA RNA’s funcionais rRNA – constitui, junto com proteínas, os ribossomos. tRNA – transporta aminoácidos para os ribossomos. snRNA – junto com proteínas constituem as snRNP (recombinação) Outros – snoRNA, siRNA, gRNA, scRNA, tmRNA

20 Tipos de RNA: estrutura e função
Conteúdo de RNA de uma célula RNA total ~4% 96% RNA codificante RNA não-codificante (ncRNA) Pré-RNA codificante ou hnRNA snRNA scRNA srpRNA Pré-rRNA tRNA mRNA snoRNA rRNA Pré-tRNA tmRNA e outros tipos gRNA RNAi

21 Tipos de RNA: estrutura e função
mRNA (messenger RNA) Molécula mensageira que converte a informação genética do DNA para o ribossomo. Transcriptoma: todo o conteúdo de mRNA de um organismo. mRNA em eucariotos – sintetizado como uma forma precursora, chamada pré-mRNA ou hnRNA (heterogeneous nuclear RNA). Processamento do pré-mRNA.

22 Tipos de RNA: estrutura e função
rRNA (ribosomal RNA) Juntamente com as proteínas (+50), formam os ribossomos. Ribossomos: grandes complexos para a síntese protéica. tamanho: grande, estimado pelo coeficiente de sedimentação (unidade S, Svedberg) Formado por 2 subunidades: maior e menor Procariotos – 70S Subunidade maior – 50S 23S e 5S Subunidade menor – 30S 16S Eucaritos – 80S Subunidade maior – 60S 28S, 5.8S e S Subunidade menor – 40S 18S

23 Estrutura 3D das subunidades do ribossomo procarioto
rRNA Estrutura 3D das subunidades do ribossomo procarioto 50S 30S

24 Variação intragenômica Evolução em concerto
rRNA genes rRNA nucleares Repetição in tandem Variação intragenômica Evolução em concerto

25 rRNA

26 tRNA (transfer RNA) 20 ou mais tipos de pequenas moléculas de RNA atuando na tradução. Cada tipo carrega um aminoácido específico para um sítio especificado por um códon de RNA.

27 Grupo 5’-fosfo terminal.
tRNA Grupo 5’-fosfo terminal. Braço aceptor – tronco com 7 pb, que contém grupo CCA 3’- terminal – aminoacetilado Alça D – tronco com 4 pb terminando numa alça que contém diidrouridina (DHU) Alça do anticódon – tronco com 5 pb que contém o anticódon. Alça TΨC– tronco com 5 pb contendo a sequência TΨC (onde Ψ é uma pseudouridina)

28 amino ácido + ATP → aminoacil-AMP + PPi
tRNA Aminoacilação – processo de adição de um grupo aminoacil a um composto. Na molécula de tRNA, resulta na ligação covalente de um aminoácido no terminal CCA-3`. Cada tRNA é aminoacilado (ou carregado) com um aminoácido específico por uma aminoacil tRNA sintetase. Há uma aminoacil tRNA sintetase para cada aminoácido, a despeito de poder haver mais de um tRNA e mais de um anticódon para cada aminoácido. Reconhecimento do tRNA apropriado pela sintetase não é mediado só pelo anticódon, mas também pela alça aceptora. Reação: amino ácido + ATP → aminoacil-AMP + PPi aminoacil-AMP + tRNA → aminoacil-tRNA + AMP

29 tRNA

30 Tipos de RNA: estrutura e função
snRNA (small nuclear RNA) Classe de moléculas encontrada no núcleo. Associadas à proteínas específicas, formas as snRNP (ribonucleoproteínas nucleares pequenas). Um grande grupo de snRNA é conhecido como snoRNAs (small nucleolar RNAs). Importantes na biogênese de rRNAs e outros genes de RNA (tRNA e snRNA). Localizados nos nucléolos (lugar de maior síntese de RNA) Atuam: Nas reações de recombinação (splicing) (remoção de introns do hnRNA); Na regulação de fatores de transcrição ou da RNA polimerase; E, na manutenção dos telômeros.

31 Tipos de RNA: estrutura e função
RNAi (RNA interference) Sistema das células que ajuda a controlar a expressão de genes. Mecanismo de defesa da célula contra invasões (sobretudo virais). Aplicações biotecnológicas. Dois tipos de RNAs participam deste processo: miRNA (microRNA) e siRNA (small interfering RNA). dsRNA exógenos são inicialmente clivado pela enzima Dicer. Fragmentos pequenos de pb de dsRNA (siRNA) são separados em fitas simples e integrados à RISC (RNA-induced silencing complex). siRNA pareia com mRNA complementar, induzindo clivagem deste mRNA. dsRNA exógeno é detectado e ligado por uma proteína efetora, que atua como a Dicer. Este caminho inicial pode ser amplificado pela célula através da síntese de siRNAs secindários, usando siRNAs primários como molde. Estes são distintos dos siRNAs produzidos pela Dicer, e são produzidos por uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRP).

32 RNAi

33 miRNAs são similares aos siRNAs, após sua maturação.
RNAi miRNAs são similares aos siRNAs, após sua maturação. Transcrito primário de miRNA (pri-riRNA) é processado em um pre-miRNA (70 pb, haste-alça) pelo complexo microprocessador (MPC). MCP consiste de uma RNase III e uma proteína ligadora à dsRNA. A porção dsRNA do pre-miRNA é ligada e clivada pela Dicer, para produzir o miRNA maduro, para ser incorporada ao complexo RISC. A partir daí miRNA e siRNA compartilham a mesma maquinaria celular. miRNAs são produzidos a partir de Dna não-codificante. Ajudam no controle da expressão gênica, principalmente durante o desenvolvimento.

34 RNAi